隔药饼灸调控子宫内膜异位症小鼠磷脂酰肌醇3激酶信号通路的研究

辛 卉 周平生 徐 鹏 周志刚

(1 江西中医药大学研究生院,南昌,330004; 2 江西中医药大学国际教育学院,南昌,330004; 3 江西中医药大学中医学院,南昌,330004)

子宫内膜异位症(Endometriosis,EMT)是妇科常见病,疼痛是其最常见的临床症状,并伴有其他症状,如盆腔包块、性交痛和不孕等,对女性日常生活有严重影响[1]。目前EMT的发病机制尚不明确,但大部分学者认为黏附、侵袭、血管生成是EMT的基本病理过程。中医认为EMT病机多为瘀血阻滞于胞宫,冲任失调所致[2]。有研究证明艾灸结合药物治疗对于EMT患者治疗效果优于单纯针刺患者[3]。研究表明EMT的形成与多条信号通路相关,其中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Phosphatidylinositol-3-kinase/Protein Kinase B/Mammalian Target of Rapamycin,PI3K/AKT/mTOR)信号通路在EMT发生发展过程中发挥了重要作用[4]。本研究旨在通过观察隔药饼灸关元穴对于子宫内膜异位导致的痛经小鼠子宫PI3K、AKT、mTOR表达的影响,阐明隔药饼灸对于PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响与隔药饼灸治疗EMT的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用雌性重度联合免疫缺陷病(Server Combined Immune Deficiency,SCID)小鼠42只,6～8周龄,体质量15～20 g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,动物许可证号:SCXK(湘)2019-0004,符合动物实验标准,在江西中医药大学实验动物科技中心提供的无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级实验室内饲养。饲养条件:每笼5只,12 h光照/黑暗,室温(24±2)℃,相对湿度45%～60%,排风压差>10 Pa,灭菌饲料自由进食进水。本研究通过江西中医药大学实验动物伦理委员会审批(伦理审批号:JZLLSC20210077)。

1.1.2 药物 药饼(将附子、肉桂、红花、丹参、木香、当归按照质量10∶2∶3∶4∶2∶3的比例制成药粉,以黄酒调和做成直径约1 cm,厚度约0.5 cm大小的药饼);艾绒(江西鄱艾科技有限公司,批号:20190411);缩宫素注射液(上海上药第一生化药业有限公司,批号:200519);戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司广州分公司,批号:450A);达那唑胶囊(江苏联环药业股份有限公司,批号:03020181201)。

1.1.3 试剂与仪器 BCA蛋白定量试剂盒(批号:20201026)、ECL超敏发光试剂盒(批号:20201125)、电泳液(批号:20201027)、转膜液(批号:20201027)、彩色预染蛋白质分子量标准(批号:20201129)、辣根过氧化物酶标记抗兔/抗小鼠二抗(批号:20201129),以上试剂均购自上海威奥生物科技有限公司。小型垂直电泳槽(型号:165-8001)、迷你湿转印槽(型号:170-3930)、基础电源(型号:164-5050),以上仪器均购自美国Bio-Rad伯乐公司;组织匀浆器(北京鼎昊源公司,型号:TL-2010S);全波长酶标仪(Thermo,美国,型号:MutiskanTM GO)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将42只小鼠适应性饲养7 d后,根据随机区组分组法将小鼠分为正常组(n=8)和造模组(n=34)。除正常组外,造模组均参照造模方法建立子宫内膜异位小鼠模型[5],手术前2 d给予补佳乐0.5 mg/kg灌胃,使小鼠处于统一动情期(阴道涂片为大量无核角化细胞)。采用3%戊巴比妥钠溶液(50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,纵向切开腹壁,暴露左侧子宫,并结扎子宫两端,取中间一段子宫;纵向剖开取出的子宫,将子宫内膜及肌层分离成大小为5 mm×5 mm的片段,用7-0无菌眼科线将子宫内膜面固定于腹腔内壁上,并在腹腔内适量撒入头孢氨苄胶囊粉末,最后逐层关腹、消毒。7 d后随机挑选2只造模的小鼠,颈椎脱臼法处死观察病灶处内膜形态和体积,当病灶部位出现直径5～8 mm的半透明囊肿,内有液体积聚,并且有血管形成,则提示造模成功。随后按照随机区组分组法分为4组:模型组、西药组、隔药饼灸组、艾灸加西药组,每组8只。

1.2.2 给药方法 1)造模结束后第28天起,隔药饼灸组小鼠在关元穴进行隔药饼灸,1次/d,每只灸4壮/次,持续时间约15 min,连续14 d。2)造模结束后第28天起,艾灸加西药组先给予达那唑混悬液(以36 mg/kg给药)灌胃,而后再在关元穴隔药饼灸,1次/d,每只4壮/次,连续14 d。3)造模结束后第28天起,西药组每天给予达那唑混悬液(以36 mg/kg给药)灌胃,连续14 d。4)造模结束后第28天起,正常组和模型组均给予等容积的生理盐水灌胃,连续14 d。

1.2.3 取材 末次治疗24 h后,在无菌条件下开腹,暴露腹腔后找到并分离出异位子宫内膜组织,使用磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffered Saline,PBS)缓冲液清洗后,存于-80 ℃冰箱用于后续蛋白质印迹法(Western Blotting)实验检测。

1.2.4 检测指标与方法

1.2.4.1 小鼠扭体反应 自治疗第8天起,每次治疗结束1 h后,通过对小鼠注射2个单位缩宫素后观察并记录30 min内小鼠扭体反应的次数。小鼠扭体反应的标准为:小鼠躯干伸展,腹部双侧向内凹同时收缩,一侧后肢与臀部发生内旋[6]。

1.2.4.2 小鼠子宫异位组织(囊泡)体积及其抑制率 造模4周后,在无菌条件下开腹,用游标卡测量并记录异位内膜(囊泡)的体积长(mm)×宽(mm)×高(mm);末次治疗24 h后,麻醉小鼠后逐层开腹,观察异位子宫组织(囊泡)形态及大小并测量其长、宽、高(mm),计算其体积及抑制率[7]:异位内膜组织(囊泡)生长抑制率=(治疗前异位内膜组织体积-治疗后异位内膜组织体积)/治疗前异位内膜组织体积×100%。

1.2.4.3 蛋白质印迹法检测 用酶抑制剂三联装提取小鼠子宫内膜异位组织总蛋白,用蛋白质定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit,BCA kit)法测出其总蛋白浓度。采用蛋白质印迹法,经电泳、转膜、封闭后加入PI3K、AKT、mTOR、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)一抗孵育(1∶1 000)过夜后,再洗膜后继续二抗孵育(1∶2 000)2 h,再进行洗膜、曝光显影、定影,分析蛋白表达水平。

2 结果

2.1 各组小鼠扭体反应结果 与正常组比较,模型组、西药组、隔药饼灸组、艾灸加西药组小鼠扭体反应次数增多,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,西药组、隔药饼灸组、艾灸加西药组小鼠扭体反应次数低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);与西药组比较,隔药饼组、艾灸加西药组小鼠扭体反应次数减少,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠扭体反应结果次,n=8)

2.2 各组小鼠生长抑制率和异位组织体积比较 西药、隔药饼灸、艾灸加西药均可以缩小囊泡生长体积,隔药饼灸组与艾灸加西药组小鼠囊泡生长抑制率低于西药组小鼠;与模型组比较,西药组、隔药饼灸组、艾灸加西药组小鼠治疗后异位子宫组织体积均减小(均P<0.05);与西药组比较,隔药饼灸组和艾灸加西药组小鼠治疗后异位子宫组织体积均减小(P<0.05);隔药饼灸组小鼠与艾灸加西药组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2,图1。

图1 各组小鼠囊泡大小比较

表2 各组小鼠生长抑制率和异位子宫组织体积比较

2.3 各组小鼠子宫PI3K/AKT/mTOR表达比较 与正常组比较,模型组小鼠异位内膜组织中的PI3K、AKT、mTOR表达增高,差异均有统计学意义(均P<0.05);与模型组比较,西药组、隔药饼灸组、艾灸加西药组小鼠异位内膜组织中的PI3K、AKT、mTOR表达均下降,差异均有统计学意义(均P<0.05);与西药组比较,艾灸加西药组、隔药饼灸组小鼠异位内膜组织中的PI3K、AKT、mTOR表达均下降,差异均有统计学意义(均P<0.05);与隔药饼灸组比较,艾灸加西药组小鼠异位内膜组织中的PI3K、AKT、mTOR表达均下降(均P<0.05)。见表3,图2。

图2 各组小鼠异位子宫PI3K/AKT/mTOR电泳条带

表3 各组小鼠子宫PI3K/AKT/mTOR表达比较

3 讨论

EMT是妇科常见病,其主要表现为进行性持续加重的经期腹痛、慢性盆腔痛、不孕症等。研究表明,周期性痛经可使女性产生焦虑、抑郁等负面情绪,影响患者身心健康,给患者日常生活及工作带来困扰[8-10]。

根据EMT病因及临床表现,在中医学中可将其归属于“痛经”“月经不调”等范畴[11]。隔药饼灸作为隔物灸中较为常见的一种类型,具有鲜明的中医治疗优势[12-13],一方面能发挥灸的作用,另一方面通过皮肤组织对药物的进一步吸收从而发挥其药理效应,充分发挥了艾灸与药物和穴位之间多重相互作用。虽然目前灸法的作用机制尚不明确,有研究表明隔药饼灸可抑制EMT血管的异常增生[14],并且可以影响EMT裸鼠异位内膜组织微RNA(miRNA)的表达,揭示了隔药饼灸的作用机制[15-16]。研究发现针灸治疗EMT主要取穴为关元、三阴交等,以任脉、足太阴脾经为主[17]。前期文献研究发现针灸治疗EMT的疗效优于中、西药组;在痛经视觉模拟评分法评分方面,针灸效果更佳[18]。《医宗金鉴·刺灸心法要诀》中有:“关元补虚泻浊遗。”关元穴是任脉上重要的穴位,具有培肾固本、补气回阳的功效,也是临床治疗痛经的常用穴之一。杨东霞等[19]、李茜[20]的研究发现近年来通过艾灸关元穴等治疗EMT疗效优于其他治疗方法,并且散结止痛、活血化瘀效果明显。在隔药饼灸中,药饼的主要成分有附子、肉桂、红花、丹参、木香等。其中附子、肉桂善于补火助阳、回阳救逆、散寒止痛、温通经脉,红花、丹参善于活血通经、散瘀止痛,木香可以行气止痛等。虽然目前尚不能明确隔药饼灸的作用机制,但在药饼灸及穴位刺激的共同作用下,EMT模型小鼠扭体次数显著低于模型组,证明在关元穴上进行隔药饼灸治疗能够有效缓解EMT小鼠疼痛症状,具有良好的镇痛效果。

EMT的发病机制目前尚不明确,但有研究表明相关信号通路的异常激活以及多细胞因子的共同作用都会影响异位内膜的黏附、侵袭,血管生成及凋亡[14,21-22]。PI3K/AKT/mTOR是EMT发病中的一条关键信号通路[23],广泛存在于细胞中,具有调节细胞的生长、增殖、凋亡的作用。在EMT中,当炎症介质刺激细胞后,活化细胞内的PI3K且磷酸化蛋白活化AKT[24];被激活后的PI3K-AKT通过磷酸化进一步将活化mTOR,mTOR受p-AKT调控,作为其下游靶蛋白,活化后的mTOR能促进细胞的生长、增殖及凋亡[25]。LIU等[26]研究发现抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路可以缓解EMT模型大鼠坐骨神经痛症状。梁莉等[27]研究发现EMT痛经大鼠异位内膜组织PI3K-AKT信号通路相关基因蛋白PI3K、AKT水平与异位内膜生长正相关。

通过测定各组小鼠异位内膜组织中的PI3K、AKT及mTOR表达水平,以及异位内膜组织体积观察比较,本研究认为EMT的异位内膜生长与组织中PI3K、AKT及mTOR蛋白高表达相关,而隔药饼灸组的PI3K、AKT及mTOR蛋白水平降低更为显著,推测在关元穴上进行隔药饼灸应该能够有效抑制EMs模型小鼠异位内膜组织中PI3K、AKT及mTOR的表达,从而抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活,缓解小鼠痛经症状,对EMT起到正向的治疗作用。

综上所述,从行为学角度,通过小鼠扭体反减少,观察到隔药饼灸对于EMT的痛经症状具有良好的镇痛作用。从形态学角度观测到囊泡体积的减小及生长抑制率的降低证明隔药饼灸对于EMT小鼠异位病灶的生成具有抑制作用。从分子水平角度,在进行隔药饼灸治疗后,PI3K、AKT表达水平降低,进而抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路、抑制PI3K及AKT进一步磷酸化,弱化mTOR的激活,从分子层面证明隔药饼灸对于EMT模型小鼠是有效的。因此,我们推测在关元穴实施隔药饼灸,可以减轻疼痛烈度并抑制囊泡生长,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路中关键蛋白PI3K、AKT及mTOR的表达有关。

利益冲突声明:无。