基于网络药理学探究香砂枳术丸治疗功能性消化不良的作用机制与实验验证

李雪岩 罗志强 韩 星 杨文宁 陈洪娇 江晓泉 森慕黎 汪国鹏 刘 洋

(1 北京中医药大学中药学院,北京,102488; 2 北京中医药大学生命科学学院,北京,102488;3 中财瀚熙〔北京〕生物科技发展有限公司,北京,101503)

香砂枳术丸,最早出自《景岳全书》,由枳实、白术、砂仁和木香组成,是《中华人民共和国药典》收载的基本药物。其中木香为君药,枳实为臣药,具有健脾开胃、顺气宽胸、行气消痞的功效,可用于脘腹疼痛、食欲不振、脾虚气滞等症。现代药理研究表明,此制剂具有调节胃肠运动,促进消化的功能,现常用于治疗功能性消化不良(Functional Dyspepsia,FD),疗效较为显著[1-3]。

FD是临床消化系统的常见病症,据流行病学统计,全球范围内FD患病率为10%～30%,其中亚洲人群患病率8%～23%,且有升高的趋势,严重影响了人们的生命质量[4-5]。目前,西医暂没有明确针对FD的药物,而中药具有多成分、多靶点、多通路的优势,通过明确疾病的病因、病机和辨证论治,可有效地缓解症状、降低复发率,极大地提高患者的康复率。

“网络药理学”最早由英国药理学家HOPKINS于2007年提出[6],研究者可从生物信息学和系统生物学的角度,整体研究中药复方的药理作用机制,这与中药整体观的思路不谋而合。

中药复方是按照配伍规律将多种不同中药按一定比例组合而成的一种经典给药形式,在我国医疗体系中发挥着重要的作用。然而由于中药复方所涉及的成分较为复杂、靶点众多,而且缺乏探索中药复方组合规律的方法,难以完全阐释中药复方防病、治病的作用机制。ZHANG等[7]通过构建网络药理学平台,以清络饮为研究对象,揭示了其抗类风湿性关节炎的炎症反应和免疫反应等关键过程,为日后对中药复方深入系统研究提供了理论参考。基于网络药理学的理论,逍遥散、四妙丸、桃红四物汤等经典中药复方治疗慢性疾病的作用机制逐渐被揭示并得到证实[8-11]。因此,本文以网络药理学的研究思路,结合分子对接,探索中药复方制剂香砂枳术丸对治疗FD的潜在作用机制,为其实验研究提供理论依据与参考。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 数据分析平台及软件 中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php);中药分子机制生物信息学分析工具(Bioinformatics Analysis Tool of Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine,BATMAN-TCM,http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm);Perl语言;在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,https://omim.org);UniProt蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/);治疗靶点数据库(Therapeutic Target Database,TTD,https://www.db.idrblab.org/ttd/);Drug Bank数据库(https://www.drugbank.ca/);GeneCards数据库(https://www.genecards.org/);STRING数据库(http://string-db.org/);Cytoscape软件;MOE软件;RCS PDB数据库(http://www.rcsb.org/);DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)。

TCMSP是由西北大学计算生物学实验室建立的中草药系统药理学平台,包括是《中华人民共和国药典》注册的499种中药及化合物(共计30 000余个),是网络药理学常用的分析平台[12]。通过在“Herb name”项下分别输入4味中药进行检索活性成分,并且以影响药效的关键参数类药性(Drug Likeness,DL)和口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)作为筛选条件[13],最小值分别设定为0.18和30%得到活性成分。BATMAN-TCM是国内首个基于网络药理学研究中药分子机制的在线生信研究平台,可实现中药及复方成分和靶点的预测和分析[14]。通过在“Formula”项下输入“XIANG SHA ZHI ZHU WAN”,将“Score cutoff”设定为30,建立活性成分数据库。

1.1.2 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级SD大鼠,雄性,7周龄,体质量约220 g,购于北京斯贝福生物技术有限公司,实验动物生产许可合格证号:SCXF(京)2019-001,适应性饲养7 d,温度25～27 ℃,相对湿度50%～70%,实验前12 h禁食不禁水，严格遵循北京中医药大学伦理部的伦理标准(伦理审批号：BUCM-4-2022061501-2061)。

1.1.3 药物 香砂枳术丸(安徽亳州,批号:2023-3-15);多潘立酮(西安杨森制药有限公司,批号:MKJOX54)。

1.1.4 试剂与仪器 活性炭粉(天津市登峰化学试剂厂,批号:20221223);羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司,批号:20200713);蔗糖(西陇科学股份有限公司,批号:2105062);氯化钠注射液(石家庄四药有限公司,批号:2206081907);大鼠5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)试剂盒,大鼠血管活性肠肽(Vasoactive Intestinal Peptide,VIP)试剂盒,大鼠白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)试剂盒(北京冬歌博业生物科技有限公司,货号:DG20153D,DG20146D,DG94490Q)。酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司,美国,型号:MultiSkan FC);超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司,型号:KQ5200E);电子分析天平(Sartorius公司,德国,BSA2202S);高速冷冻离心机(Sigma离心机,德国,型号:1-15PK)。

1.2 方法

1.2.1 香砂枳术丸活性成分靶点的筛选 分别在TCMSP和BATMAN-TCM平台筛选活性成分相关靶点,使用Perl语言和UniProt进行靶点标准化,将Organism设置为“Homo sapiens(Human)”,统一使用UniProt ID表示,建立成分靶点数据库。

1.2.2 FD靶点的筛选 以“Functional Dyspepsia”为检索关键词,分别在TTD、Drug Bank、OMIM和GeneCards这4个国际认可的基因组数据库获取疾病靶点,建立疾病靶点数据库。

1.2.3 “中药复方-活性成分-作用靶点”网络构建 Cytoscape是一款能图形化显示数据并可数据分析的可视化软件,将获取的活性成分与靶点导入,构建“中药复方-活性成分-作用靶点”的药物靶点相互作用网络,用于探究香砂枳术丸治疗FD的药理学作用机制。

1.2.4 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)网络构建 为了明确药物靶点与疾病靶点之间的相互关系,将活性成分靶点与疾病靶点分别导入STRING数据库,将“Organism”项下设置为“Homo sapiens(Human)”,分别构建活性成分靶点和疾病靶点的PPI网络图。

1.2.5 核心靶点筛选 将“1.2.4”项下网络导入Cytoscape,使用“Merge”功能并借助Network Analyzer分析网络,选取度值(Degree)大于2倍中位数的靶点作为候选核心靶点。采用CytoNCA插件对候选核心靶点进行网络拓扑学分析。以接近中心性(Closeness Centrality,CC)和介度中心性(Betweeness Centrality,BC)为标准,筛选标准为大于1倍中位数。符合标准的靶点即可作为核心靶点进行生物信息学分析。

1.2.6 生物信息学分析 将核心靶点输入DAVID,使用“Functional Annotation”功能,将“Gene List Manager”和“Population Manager”项下均设置为“Homo sapiens”后进行生信学分析。查看Gene Ontology项下的细胞组分(Cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)、生物过程(Biological Process,BP)进行GO富集分析;依据P-Value和通路基因富集数进行KEGG富集分析。

1.2.7 分子对接验证 从RCSB PDB蛋白数据库获取核心靶点度值最大的2个靶点INS(PDB ID:1TYL)、AKT1(PDB ID:3BDY)的3D结构及自带配体,选取物种为“Homo sapiens”;收集75个活性成分的3D结构,使用MOE对接软件对靶蛋白预处理,分子对接后通过打分值评价活性成分、自带配体与靶点结合活性大小,验证上述网络分析的结果。

1.3 实验分析

1.3.1 分组与模型制备 将30只SD大鼠通过随机数字表分成空白组、模型组、香砂枳术丸组和多潘立酮组,每组6只。除空白组外,其余各组采用不规则喂养和夹尾刺激法建立FD大鼠模型:大鼠正常饮水,隔日禁食,每天用长海绵钳夹大鼠尾部远端约1/3处,0.5 h/次,每隔3 h刺激1次,4次/d,连续7 d。造模结束后,恢复正常的饮食和饮水。

1.3.2 给药方法 各给药组分别灌胃相应香砂枳术丸(7.2 g/kg)与多潘立酮混悬液(9×10-3g/kg),空白组和模型组灌胃等体积(3 mL)生理盐水,2次/d,连续14 d。

1.3.3 检测指标与方法 一般行为学观察:对实验过程中各组大鼠的食物摄入量、饮水量、体质量、活动度、毛发、粪便等进行观察和评估。

炭末推进实验:大鼠最后1次给药后,禁食不禁水后灌胃炭末液,30 min后腹主动脉取血处死,用直尺测量小肠全长以及炭末达最前端的距离,计算大鼠小肠炭末推进率(炭末推进距离/小肠全长×100%)。

大鼠血清IL-6、VIP以及5-HT含量检测:大鼠腹主动脉取血后,静置20 min,离心机以3 500 r/min,离心半径10 cm,离心15 min取上层血清,按照试剂盒说明书中步骤使用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)测定上述药效学指标。

2 结果

2.1 活性成分及靶点筛选结果 TCMSP和BATMAN-TCM共筛得活性成分75个,其中白术中化合物7个;砂仁中化合物24个,枳实中化合物33个;木香中化合物9个;共有成分有2个;共得到靶点292个。见表1。

2.2 FD疾病靶点筛选结果 共筛选得到FD疾病靶点666个。见表2。

表2 香砂枳术丸对大鼠体质量增量的影响

表2 疾病靶点统计(个)

2.3 “中药复方-活性成分-作用靶点”网络构建 构建的“中药复方-活性成分-作用靶点”网络共包括371个网络节点和1 353条边,在筛选得到的292个靶点中,60%以上的靶点至少与2个化合物发生相互作用,而且不同的活性成分也作用于相同的靶点。此外,前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase 2,PTGS2)基因、孕酮受体(Progesterone Receptor,PGR)基因、雌激素受体1(Estrogen Receptor 1,ESR 1)基因在此网络中是度值前3的靶点,与20个以上的化合物发生相互作用。PTGS2,又称之为环氧合酶(Cyclooxygenase,COX)在网络中度值最高。见图1。

图1 “中药复方-活性成分-作用靶点”网络

2.4 PPI网络构建 活性成分靶点PPI网络获得节点288个,PPI网络边有3 400条;疾病靶点PPI网络获得节点587个,PPI网络边有16 922条,用于下一步核心靶点的选择。

2.5 核心靶点筛选结果 络拓扑分析结果表明BC和CC的中位数值分别为0.002和0.491,故使用BC>0.002和CC>0.491为筛选条件获取核心靶点,最终获取核心靶点90个。随着度值增大,节点的大小与颜色逐渐加深,位于中心的节点为度值最大的节点。见图2～3。

图2 核心靶点筛选流程及结果

图3 核心靶点网络

2.6 生物信息学分析结果 香砂枳术丸在治疗FD的分子功能主要涉及一氧化氮生物合成过程的正调控(Positive Regulation of Nitric Oxide Biosynthetic Process)、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控(Positive Regulation of Transcription from RNA Polymerase Ⅱ Promoter)、基因表达正调控(Positive Regulation of Gene Expression)、凋亡过程的负调控(Negative Regulation of Apoptotic Process)、DNA转录的正调控(Positive Regulation of Transcription,DNA-templated)等。生物过程主要富集在同源蛋白结合(Identical Protein Binding)、酶结合(Enzyme Binding)、蛋白结合(Protein Binding)、转录因子结合(Transcription Factor Binding)、生长因子活性(Growth Factor Activity)等。细胞组分主要位于细胞外空间(Extracellular Space)、胞外区(Extracellular Region)、细胞溶质(Cytosol)、蛋白复合体(Protein Complex)、细胞质核周区(Perinuclear Region of Cytoplasm)等。

香砂枳术丸治疗FD的药理作用机制主要涉及癌症通路(Pathways in Cancer)、细胞凋亡通路、炎症通路等,如PI3K-AKT信号通路(PI3K-AKT Pathway)、缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF-1)信号通路、叉头盒O(Forkhead box O,FoxO)蛋白信号通路、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)信号通路等。

2.7 分子对接 对接分数显示,75个活性成分中有90%以上的成分与INS、AKT1对接分数大于阳性参照物。见图4～5。

图4 INS与MS-2分子对接

图5 AKT1与MS-1分子对接

2.8 大鼠一般情况 通过观察发现,与空白组比较,模型组大鼠普遍出现活动减缓,活跃度降低,毛发少乱,枯黄,易怒和打斗,进食量和进水量逐渐减少,大便变干,可认定造模成功。香砂枳术丸组和多潘立酮组大鼠的体质量增量显著高于模型组大鼠,差异有统计学意义(P<0.05),且与空白组大鼠增长幅度接近。见表2。

2.9 香砂枳术丸对大鼠炭末推进率的影响 与空白组比较,模型组的炭末推进率差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,香砂枳术丸组与多潘立酮组的炭末推进率有所上升,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 香砂枳术丸对大鼠炭末推进率的影响

2.10 香砂枳术丸对大鼠血清IL-6、VIP以及5-HT的影响 与空白组比较,模型组大鼠血清IL-6和VIP含量显著升高,血清中5-HT含量下降,差异均有统计学意义(均P<0.05);与模型组比较,香砂枳术丸组与多潘立酮组大鼠血清的IL-6和VIP含量显著下降,血清中5-HT含量显著提高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图6～8。

图6 香砂枳术丸对大鼠血清IL-6的影响

图7 香砂枳术丸对大鼠血清VIP的影响

图8 香砂枳术丸对大鼠血清5-HT的影响

3 讨论

DAVID是一个基于基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)数据库的高通量生物信息平台,整合了各种生物学数据(如大量的基因序列和蛋白列表)和分析工具,可以系统全面地提供生物学信息[15]。

“中药复方-活性成分-作用靶点”网络构建表明中药复方在治疗疾病方面具有多成分、多靶点的协同治疗作用,而不是仅仅作用于某一个靶蛋白,符合中医药整体观的治疗原则。此外,前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase 2,PTGS2)基因、孕酮受体(Progesterone Receptor,PGR)基因、雌激素受体1(Estrogen Receptor 1,ESR 1)基因在此网络中是度值前3的靶点,与20个以上的化合物发生相互作用[16]。表明其结合活性良好,也证明此次网络药理学研究的预测结果具有可靠性,可为日后的分子生物学研究提供有价值的参考。

本研究使用网络药理学的方法,探究了香砂枳术丸治疗FD的作用机制。首先分析了复方的活性成分,并使用Cyctoscape构建了活性成分与靶点的网络图,证明此复方协同治疗作用。同时选取了此网络度值最高的3个靶点,认为这些节点在治疗FD中具有重要作用。经多次筛选得出核心靶点后,这3个靶点仍涵盖其中,且度值较高,也证明其治疗疾病时的重要性。借助GO和KEGG分析,从生物信息学的角度对核心靶点进行富集研究。最后使用分子对接,对本研究的结果进行验证。

白术作为补气健脾第一要药,临床多用于治疗胃肠道疾病,实验证明白术炮制后,白术内酯含量出现显著升高,而其含有的挥发油成分,如苍术酮,与生品比较有所下降[17-18]。药理研究表明,白术的水煎液对于大鼠胃肠道具有双向调节作用,马晓松等[19]以实验豚鼠为研究对象,初步研究了不同浓度白术水煎液对于动物胃肠运动的影响,为白术对于便秘以及泄泻的治疗提供了理论基础。白术所含的内酯类成分还可以对抗炎症介质,抑制IL-6、TNF的表达,能减轻胃黏膜损伤[20]。

生品枳实,具有很强的破气作用,药理研究表明,其有效成分辛弗林、新橙皮苷以及柚皮苷对于脾虚大鼠胃肠道有显著的促进作用,具体机制与促进胃肠道激素分泌有关[21]。另有研究证明,枳实的水提取液可通过上调5-HT受体4以及神经丝蛋白H促进神经丛修复,进而缓解慢性传输型便秘[22]。麸炒后可增加柚皮苷等黄酮类化合物的溶解度和脂溶性,进而能使药物利于透过细胞膜增加药物吸收,增加对于胃肠道的作用[23]。木香,用于脘腹胀痛、食积不消等症状,具有代表性的成分如木香烃内酯和去氢木香内酯[24]。研究证实,木香显著改善乙醇所导致的小鼠胃溃疡的形成,其作用机制与改善细胞氧化应激反应,促进细胞的增殖有关,此研究为木香作为胃肠道保护药提供了新的理论基础[25]。砂仁多含有挥发油成分如异龙脑、樟脑,研究证明,挥发油成分是对胃黏膜保护的主要成分[26]。

根据最新的罗马Ⅳ标准,FD症状起源于胃、十二指肠,主要症状表现为早饱感、餐后腹胀,上腹痛及上腹部烧灼感。根据不同临床表现,具体可以分为上腹痛综合征和餐后不适综合征2种[27]。我国各种来源的经典古籍之中并没有关于FD的记载,但可以根据临床表现将其归为痞满。“痞满”一词,首见于《黄帝内经》:“心胃生寒,胸膈不利,心痛痞满,头痛善悲。”中医认为FD多在肝脾不和,导致肝气郁结、脾胃虚弱,故治疗关键在于健脾开胃,行气消痞,此疾病的发病原因在于幽门螺杆菌导致感染、脑-肠轴紊乱、胃肠动力异常、内脏高敏感性等[28-29]。

PI3K-AKT信号通路是一类较为经典的信号转导通路,可以调节不同的细胞功能,例如细胞生长、代谢、存活以及合成等方面发挥着重要的作用[30]。此通路与胃黏膜细胞具有很强关联性,可以参与上皮细胞的生长,与上皮细胞存活直接相关[31]。在FD病情中,会出现腹部疼痛的症状,这与胃酸异常分泌损伤胃黏膜上皮细胞有关,而胃黏膜具有抑制胃液中氢离子渗透的作用[32]。在PI3K-AKT信号通路上,通过生长因子或信号转导复合物激活PI3K,产生信使磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(Phosphatidyl-inositol,3,4,5 Triphosphate,PIP3),逐步使本通路的核心分子AKT被激活,进而调节其下游靶点在胃组织的表达,促进胃黏膜上皮细胞再生。与PI3K-AKT信号通路类似,FoxO信号通路在细胞凋亡中也发挥了较为重要的作用,FoxO在细胞质中合成,后进入细胞核中诱导细胞的凋亡。近期有研究表明,FoxO信号通路与幽门螺杆菌所致的胃黏膜细胞凋亡有关,具体作用机制可能是通过此通路对胃黏膜上的细胞进行调控[33]。

核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)信号通路虽未出现在所展示富集基因数更多的通路中,但是也具有很高的显著性(P<0.01)。作为PI3K-AKT下游通路,通过TNF、IL等细胞因子激活后,可在细胞凋亡、生长等方面发挥重要作用。目前有研究表明,NF-κB信号通路的激活与幽门螺杆菌感染的发生具有相关性,当胃肠道感染幽门螺杆菌后,会损伤胃黏膜,严重者还会诱发癌症的发生,通过分析关键靶点及其在通路的富集情况,推测机制可能通过调控表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF),IL-6进而抑制幽门螺杆菌感染,减轻炎症反应。

在关于FD的靶点中,脑-肠轴一直被认为是一个关键治疗靶点,其在人体代谢中也发挥着一定的作用,例如糖尿病以及肥胖的发生[34]。脑-肠神经细胞受到来自中枢、肠道、自主神经的调节,通过释放相关脑-肠肽(胃肠道激素)进而维持其稳定健康运行,相关脑-肠肽激素水平的异常升高或者降低都是引发功能性消化不良的主要诱因之一[35-37]。从中医角度来说,肝气犯胃,引起腹痛、腹胀以及便秘等胃肠道相关的不良反应,相应的治疗方案即为行气健脾开胃,证明中医在很早就对脑-肠轴这一概念有所研究。本复方中的白术、枳实、木香的水提液均可以起到一定的行气作用。从通路的角度来看,神经营养因子信号通路(Neurotrophin Signaling Pathway)是一类与神经细胞分化和存活有关的营养因子的通路,家族中包括神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)、脑源性神经营养因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)、神经营养因子(Neurotrophin,NT)-3和NT-4。此通路可以连接多种细胞内信号级联,包括MAPK通路、PI3K-AKT信号通路。FD患者可以通过激活此通路,将本来异常的肠神经系统以脑-肠轴的作用机制进行调节,降低肠道的高敏感性,使得神经因子恢复为正常的状态。与此同时,抑制NF-κB信号通路,减少炎症介质的释放,进一步调节患者的心理因素,二者发挥协同作用达到神经调节的效果[34]。动物实验也表明,香砂枳术丸可以显著调节FD大鼠体内IL-6、VIP以及5-HT的含量,显示其可以通过影响NF-κB、NT等通路上的关键靶点发挥药效,也从一定程度上证明了网络药理学研究的可靠性,可为日后的深入药效学研究提供研究思路。

值得注意的是,除了富集这些通路外,关键靶点还富集到癌症通路。FD的其中一个重要病因即为幽门螺杆菌的感染,现已有研究表明,幽门螺杆菌是胃癌的重要启动子,与癌症某些基因的表达有显著相关性,并且是造成胃癌的重要原因之一[38]。癌症通路的富集,推测此复方具有降低幽门螺杆菌诱发胃癌发病率的潜力。

综上所述,本研究认为,香砂枳术丸治疗FD的作用机制主要在于PI3K-AKT信号通路、FoxO信号通路、NF-κB信号通路、NT信号通路这4条通路,分别对体内幽门螺杆菌导致感染、脑-肠轴紊乱以及内脏高敏感性进行调控,以达到治愈功能性消化不良的目的。

利益冲突声明:无。