青贮玉米链格孢叶斑病菌生物学特性及其室内防治药剂筛选

马伟丽, 马桂花, 常建萍, 邹海涛, 祁鹤兴

(青海大学农牧学院,青海 西宁 810016)

青贮玉米是指在适宜的收获期内收获的包括果穗在内的地上全部绿色植株,经切碎、加工,用青贮发酵方法来制作的玉米饲料,用以饲喂牛、羊等草食牲畜[1,2]。青贮玉米可为农牧交错地区饲草生产和生态环境保护提供新途径,对弥补饲草料短缺、减缓草地退化、保障饲料冷季供应具有重要意义[3]。青海省作为西北地区“粮改饲”和“草牧业”的试点区[4],玉米种植面积约2.7×104hm2以上。青贮玉米是青海省玉米发展的优势产业[5],但随着青海省青贮玉米种植面积的不断扩大,链格孢叶斑病也逐年加重,严重影响了其产量和品质。

青贮玉米链格孢叶斑病主要为害叶片、苞叶和叶鞘。病斑初期呈椭圆形,近圆形水渍状,病斑扩展不受叶脉限制,病健交界处界限明显,中央灰白色,边缘红褐色。后期病斑呈长梭状,部分病斑中央破裂穿孔,呈撕裂状干枯坏死[6,7]。该病害由多种链格孢属(Alternaria)真菌引起。链格孢属为无性型真菌,弱寄生菌,但对农作物的致病性及危害是不容忽视的。该属种类多且寄主范围广泛,严重影响农作物的产量,长期以来给农业生产造成了巨大损失[8,9]。2018-2021年,研究组在青海省海东市民和县、西宁市湟中县和大通县、黄南藏族自治州尖扎县青贮玉米种植区进行病害调查时发现,链格孢叶斑病发生普遍,由交链格孢(Alternariaalternata)、芸薹链格孢(A.brassica)、致密链格孢(A.compacta)、极细链格孢(A.tenuissima)和茄链格孢(A.solani)等多种链格孢引起叶斑病。该病害的发生制约着青贮产业的健康发展[10]。

目前,国内对青贮玉米链格孢叶斑病的研究还较少,仅对甘肃省[6]、云南省[7]、青海省[10]、黑龙江省[11]和海南省[12]等的玉米链格孢叶斑病病原菌有过报道。因此,本研究在前期研究的基础上对5种青贮玉米链格孢叶斑病菌最适碳、氮源进行筛选,同时采用菌丝生长抑制法筛选室内高效防治药剂,为后续开展病害综合防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

供试菌株 MH1841-A、 JZYM-112-2、 DT1882-A、 JZYM-19和DT18125-B于2018-2019年从青海省西宁市大通县、湟中县,海东市民和县和黄南藏族自治州尖扎县青贮玉米链格孢叶斑病病叶分离所得,由青海大学植物病理学实验室保存。经形态学和分子生物学鉴定确定MH1841-A为交链格孢、JZYM-112-2为芸薹链格孢、 DT1882-A为致密链格孢、 JZYM-19为极细链格孢、DT18125-B 为茄链格孢,经致病性测定为强致病性菌株[8]。

1.2 培养基配制

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯200 g, 葡萄糖20 g,琼脂 20 g, 蒸馏水定容至1 L;基础培养基:蛋白胨4 g,葡萄糖20 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO40.5 g,K2HPO41 g,琼脂20 g,pH 值为7.0。培养基经121℃高压蒸汽灭菌20 min,备用。

1.3 杀菌剂及供试浓度

1.4 生物学特性测定

分别以葡聚糖、木糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖及淀粉替换基础培养基中的葡萄糖(20 g)作为碳源,以不加碳源作为对照(CK),分别配制对应培养基;分别以硝酸钾、酸水解酪蛋白、酶水解酪蛋白、酵母提取物、牛肉膏及尿素替换基础培养基中的蛋白胨(4 g)作为氮源,以不加氮源作为对照(CK),分别配制对应培养基。菌株在PDA平板上生长5 d后,用直径0.5 cm的打孔器取菌饼并将其放置在对应培养基中。每个碳源和氮源做3个重复,并且每皿培养基的厚度要保持一致。置于25℃培养箱培养 7 d 后,采用十字交叉法测量不同氮源或碳源培养基上的菌落生长直径和对照组的菌落直径,取3次测量的平均值,从而判断不同氮源或碳源对病原菌菌丝生长的影响。

1.5 杀菌剂抑制作用测定

采用菌丝生长抑制法[13,14]。用分析天平准确称取杀菌剂药品放于5 mL EP管中,加入一定量体积的二甲基亚砜 (DMSO),振荡至药剂充分溶解,配制成105mg/L的母液,4℃无光条件下保存备用。使用时将配置好的杀菌剂母液混于PDA培养基中梯度稀释后倒入平皿,且厚度一致,每个浓度重复3次。以加入DMSO的培养基为对照组,取直径为0.5 cm的菌饼接种到含药剂的培养基中央,放置于25℃的培养箱中培养7 d,用十字交叉法测量含药培养基中菌落生长的直径与对照组的菌落直径,根据两者之间的差值判断该种药剂在不同浓度下对该菌株的抑制作用。

使用SPSS、EXCEL软件处理数据,求得b值±标准误差、EC50、95%置信限、卡方值和P值。

2 结果与分析

2.1 病原菌最适碳源和氮源

测定9种碳源和7种氮源对菌株MH1841-A(交链格孢)、DT1882-A(致密链格孢)、DT18125-B(茄链格孢)、TJZYM-112-2(芸薹链格孢)和JZYM-19(极细链格孢)菌丝生长的影响。结果表明,碳源中淀粉、麦芽糖和葡聚糖对于5种链格孢菌株的生长均有明显的促进作用,平均生长速率在0.62～1.16 cm/d之间,而对照组平均生长速率在0.50～0.85 cm/d之间(见图1)。添加淀粉的培养基为最佳碳源,在这种培养基上菌株生长最快,5株菌株平均生长速率分别为0.96 、1.03 、1.03 、1.11 和1.16 cm/d。 甘露醇对5种菌株的促生作用最弱,平均生长速率分别为0.52 、0.80 、0.64 、0.84 和0.87 cm/d。

图1 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响

氮源中蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏对5种链格孢菌株均有明显的促进作用,平均生长速率在0.95～1.14 cm/d之间,而对照组平均生长速率在0.63～0.78 cm/d之间(见图2)。添加蛋白胨的培养基为最佳氮源,在这种培养基上菌株生长最快,5株菌株平均生长速率分别为0.97 、1.06 、1.07 、1.02 和1.14 cm/d。尿素对5株菌株的促生作用最弱,平均生长速率分别为0.59 、0.68 、0.76 、0.71 和0.92 cm/d。

图2 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响

2.2 病原菌对杀菌剂的敏感性

通过测定7种杀菌剂对MH1841-A(交链格孢)、TJZYM-112-2(芸薹链格孢)、DT1882-A(致密链格孢)、JZYM-19(极细链格孢)和DT18125-B(茄链格孢)菌丝生长的抑制作用(见表2)发现,40%氟硅唑乳油对5种病原菌具有很强的抑制作用,EC50在0.527～2.952 mg/L之间。其次,45%咪鲜胺水乳剂对5种病原菌抑制作用也较强,EC50在0.725～5.092 mg/L之间(见图3)。40%苯醚甲环唑悬浮剂和43%戊唑醇悬浮剂对5种病原菌的抑制作用一般,EC50在2.029～9.577 mg/L之间。5种病原菌对30%醚菌酯可湿性粉剂、16%多抗霉素可溶性粒剂和50%异菌脲可湿性粉剂的敏感性最差,EC50在10.510～146.567 mg/L之间。

A:45%咪鲜胺水乳剂对MH1841-A(交链格孢)的抑制效果;B:40%氟硅唑乳油对TJZYM-112-2(芸薹链格孢)的抑制效果

3 讨论与结论

本研究通过对最佳碳、氮源的分析发现,碳源中淀粉、麦芽糖和葡聚糖对于5种病原菌的生长均有明显的促进作用。其中,在淀粉培养基上菌株生长最快,为最佳碳源。氮源中蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏对5种链格孢菌株均有明显的促进作用,最佳氮源为蛋白胨。王媛媛等[15]对分离自吉林的玉米链格孢叶斑病菌(A.tenuis)最适产孢碳、氮源进行研究发现,最适碳源为麦芽糖,最适氮源为蛋白胨。卢文洁等[16]对云南省荞麦叶枯病病原菌交链格孢进行研究发现,该病原菌以麦芽糖为碳源时生长最快,以蛋白胨和牛肉膏为氮源时生长一般,而以硝酸钠为氮源时生长最佳。刘俏等[17]对青海省樱桃叶斑病菌交链格孢生物学特性进行研究发现,最适氮源为蛋白胨,最适碳源分别为肌醇和乳糖。谢皖豫[18]对引起灯台树叶枯病的病原菌宪菁链格孢(A.napiformis)生物学特性进行研究发现,最佳碳源为乳糖,最佳氮源为酵母粉。本研究发现碳源麦芽糖、氮源蛋白胨对链格孢属真菌的促生作用较强,与王媛媛等[15]的研究报道一致;与卢文洁等[16]关于最佳碳源的报道一致,最佳氮源存在差异;与刘俏等[17]关于最佳氮源的报道一致,最佳碳源存在差异;与谢皖豫[18]的研究结果差异明显。造成研究结果不同的原因可能与菌株个体差异和地域差异有关。

药剂筛选试验结果表明,45%咪鲜胺水乳剂和40%氟硅唑乳油对青贮玉米链格孢叶斑病病原菌有较好的抑制作用。王义等[19]研究发现,氟硅唑对草海桐链格孢叶斑病菌长柄链格孢菌的抑制作用最强,EC50为0.15 μg/mL。任美佳[20]的相关研究也发现,咪鲜胺和氟硅唑对引起梨黑斑病的链格孢菌抑制作用最强。本研究中苯醚甲环唑对病原菌的抑制作用一般,EC50在2.029～9.577 mg/L,而谢皖豫等[17]和王义等[19]的研究表明,苯醚甲环唑对链格孢病原菌的抑制作用明显。王媛媛等[15]报道异菌脲和咪鲜胺锰盐等药剂对玉米链格孢病菌具有较好的抑制效果,刘俏等[18]发现嘧菌酯对青海省樱桃叶斑病菌交链格孢的抑制作用最强,但是本研究中异菌脲和嘧菌酯的防治效果均较差。防治效果存在差异可能与病原菌种类、来源和寄主不同有关。咪鲜胺和氟硅唑可以用于后续青贮玉米链格孢大田防治效果测试。本试验结果为青贮玉米链格孢叶斑病菌的化学防治提供了候选药剂,为药剂的轮换使用提供了科学依据。