注射用尿促性素的冻干工艺优化

赵双双 吴玉娟

（上海上药第一生化药业有限公司 上海 200240）

注射用尿促性素是一种促性腺激素类药[1]。主要具有促卵泡生成素（FSH）的作用，促进卵巢中卵泡发育成熟并分泌甾体性激素[2]。可与绒促性素合用，用于治疗促性腺激素分泌不足所致的原发性或继发性闭经、无排卵所致的不孕症等[3]。现有的注射用尿促性素冻干工艺存在冻干周期长[4]、冻干过程不稳定[5]、生产能耗高等缺点[6-7]。本研究通过参数检测确定供试品溶液的玻璃化转变温度[8-9]、塌陷温度[10]，建立响应面模型，进行全因子和挑战性实验优化注射用尿促性素生产工艺参数，从而实现缩短冻干周期，降低生产制造能耗，节约用电成本，使优化后的冻干工艺，能够有效提高注射用尿促性素制品生产过程稳定性和产品质量。

1 材料和方法

1.1 试剂与设备

尿促性素（上海天伟生物制药有限公司）；Lyostat 5 型冻干显微镜（英国Biopharma 科技有限公司）；DSC 1 型差示扫描量热仪[梅特勒托利多科技（中国）有限公司]；Lyo-0.2、0.4 型冻干机（上海东富龙科技股份有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 差示扫描量热仪检测

将装有微量液体样品（约25 μL）的铝制40 μL 坩埚放置于差示扫描量热仪检测平台上，同时在参比槽上放置空白对照，采用Star E 程序设置温度控制程序，第1 阶段从25 ℃降温至-70 ℃，降温速率-10 ℃/min，第2 阶段由-70 ℃升温至25 ℃，升温速率5 ℃/min。检测结束后通过该程序对差示扫描量热法曲线（图1）进行分析，在降温段中出现的放热峰为样品的结晶峰，尿促性素溶液的玻璃化转变温度为-23.16 ℃。

图1 尿促性素溶液示扫描量热法检测曲线

1.2.2 冻干显微镜检测

吸取2 μL 的样品置于冻干显微镜控温平台上，通过显微镜温度控制程序Linksys 32 设置控温平台温度变化进行预冻，首先降温至-45 ℃，然后开启真空，在升华过程中以一定速率升温（2 ℃/min）。

通过冻干显微镜监测软件观测样品图像，-17.3 ℃时在干燥表面出现亮斑，确定尿促性素的崩解温度为-17.3 ℃。预冻制品温度应低于制品的凝固点（玻璃转化温度）10 ～20 ℃，即尿促性素制品预冻温度合理控制范围应为-33.16 ～-43.16 ℃。

2 结果

2.1 冻干工艺参数研究

2.1.1 预冻工艺研究

收集旧冻干工艺预冻阶段板层温度（理论温度）与制品温度数据并进行拟合（图2），发现在-20 ～-30 ℃的温度区间，因制品发生液态到固态的物理性质转化，产生放热，温度下降速率变慢，导致在该区间板层温度与制品温度线性拟合度降低。

图2 板层控制温度与制品温度拟合图

为使制品温度均匀下降，在-25 ℃增加保温阶段。随着保温时间的逐渐增加，制品温度逐渐降低，保温65 min 后，制品温度降至-20.6 ℃，且降温速率变缓（图3），因此-25 ℃保温阶段时长确定为65 min。

图3 不同温度保温时间对制品温度的影响

在-25 ℃保温65 min 后，将板层温度继续降温至-40 ℃并保温（图3），随着保温时间的逐渐增加，制品温度逐渐降低，保温50 min 后，制品温度低于-33.2 ℃，满足温度控制范围-33.16 ～-43.16 ℃，保温满120 min后，温度趋于稳定不再下降，因此-40 ℃保温阶段时长确定为120 min。

2.1.2 一次升华工艺研究

以旧工艺一次升华温度为参考，选择（-12.5±7.5）℃为保温温度进行实验（图4），发现以-20 ℃保温时，制品温度维持在-37.1 ～-26.5 ℃。以-12.5 ℃保温时，制品温度维持在-25.0 ～-20.3 ℃。以-5 ℃保温时，制品温度维持在-18.2 ～-13.1 ℃，且保温5 ～6 min 后，制品温度便超出尿促性素样品的崩解温度（-17.3 ℃）。因此选择-12.5 ～-5 ℃为保温范围进行进一步筛选。

图4 一次升华板层控制温度和制品温度变化趋势

以2.5 ℃为温度区间，分别对一次升华温度-12.5 ℃、-10 ℃、-7.5 ℃进行实验，并收集对应的制品温度（图5）。一次升华温度为-7.5 ℃和-10 ℃时，保温120 min后制品温度超出崩解温度，一次升华温度为-12.5 ℃时，保温120 min 后制品温度稳定低于崩解温度，因此确定-12.5 ℃为一次升华温度。

图5 一次升华温度对制品温度的影响

以-12.5 ℃为一次升华温度，对样品进行保温，通过水迹线褪去情况考察最优的保温时间。经过观察，当保温时间达到70 min 后水迹线完全褪去，可认为样品已完成一次升华，可进入下一阶段。因此，确定一次升华时间为70 min。

2.1.3 二次升华第一阶段工艺研究

对旧工艺进行分析，通过显著性分析实验，确认二次升华温度（A）、二次升华保持时间（B）、二次升华箱体真空度（C）对制品干燥失重（Y）的影响是显著的，将这3 个因素作为响应因子，压力升测试结果（Y）为响应值，通过Minitab 进行实验设计，建立3 因素2 水平优化表（表1），实验结果见表2。

表1 响应面实验设计表

表2 响应面实验结果

响应面模型分析3 个因素之间的交互作用，并对实验结果进行二阶多项式拟合，最终得到成品干燥失重得 率与3 个变量的二次方程模型：

检验结果采用方差分析和多元线性回归分析，使用P和F值评价回归方程的显著性，模型的P＜0.000 1，表明整个模型极为显著，可以用来研究3 个因素和响应值的交互作用。模型相关系数为0.988 3，表明实际值与模型的预测值在绝大多数情况下高度相关；修正相关系数（0.983 1）略小于模型相关系数（0.988 3）且预测修正相关系数（0.970 4）与修正相关系数（0.983 1）的差值＜0.120 0。上述结果均能表明该响应曲面能够充分反映响应值与影响因素之间的准确联系。

通过响应优化器对工艺参数进行寻优，预测得到二次升华最佳工艺参数：二次升华温度5 ℃，二次升华箱体真空度10 Pa，二次升华温度保持时间300 min，使用干燥失重法对样品进行检测，压力升测试合格（≤1.0 Pa/min）的制品干燥失重结果为6.5%，超出质量标准（≤5%），需对解析干燥阶段的工艺参数进行进一步优化。

2.1.4 二次升华后续阶段工艺研究

对样品的保温温度进行挑战性实验，结果显示板层温度最高设置在40 ℃时，样品外观正常，因此确定二次升华控制温度设置为40 ℃。在40 ℃保温过程中，观察发现部分样品在制品温度升至20 ℃时浮起，测量温度发现浮起的样品制品温度明显低于正常样品。

在干燥过程中因升温速率快、升华速率增快，导致部分样品浮起，为使制品温度均匀上升，增加20 ℃保温阶段。以20 ℃为保温温度进行实验，考察保温时间及箱体真空度。

分别考察箱体真空度为1、10、20 和30 Pa 时，制品温度变化情况。当箱体真空度数值设置为30 Pa 时，制品温度最高可升至19.4 ℃，在保温110 min 后制品温度不再上升（图6）。因此确定20 ℃保温阶段时，箱体真空度30 Pa，保温时间110 min。

图6 二次升华不同真空度对制品温度的影响

在40 ℃保温阶段，通过2×2 全因子实验设计（表3），考察箱体真空度（D）和保温时间（E）对注射用尿促性素的干燥失重（R）的影响。结合实验结果（表4），真空度为30 Pa，40 ℃保温720 min 后注射用尿促性素干燥失重值最低。

表3 全因子实验设计

表4 全因子实验结果

为提高生产效率，减少能源消耗，缩短冻干周期，以真空度30 Pa，保温温度40 ℃为条件，干燥失重≤1.0%为目标值，对保温时间进行进一步优化。保温210 min 后注射用尿促性素干燥失重＜1.0%，220 min 后干燥失重随保温时间的延长趋于稳定，因此将保温时间确定为220 min（图7）。

图7 二次升华保温时间对干燥失重的影响

2.2 冻干工艺验证

使用优化后的冻干工艺，连续进行3 个批次的样品冻干，在每一批的板层的四角和中心布置5 个取样点，分别对不同冻干板层的样品进行抽样，并检测其干燥失重，以验证优化后的冻干工艺的冻干效果。

对3 批15 个样品的干燥失重进行检测，最大值为0.9%，最小值为0.5%，平均值为0.74%（表5）。优化后冻干工艺条件下，冻干出的制品干燥失重符合中国药典标准。

表5 3批样品干燥失重分布（%）

3 讨论

优化得到的注射用尿促性素的新冻干工艺：预冻温度-25 ℃和-40 ℃，分别维持65 min 和120 min；一次升华温度-12.5 ℃，维持70 min；二次升华温度分别为5、20、40 ℃，维持300、110、220 min。

本工艺相对旧工艺，明确冻干各阶段的关键工艺参数并新增多个温度平台细化，有效降低产品干燥失重，提高产品质量和稳定性；将冻干周期从22 h 缩短至18.5 h，实现降低生产能耗，提高生产效率和过程稳定性的目的。本工艺小规模生产结果良好，表明本研究的方法和实验路径科学，但仍需在正式生产线上进行更多批次的生产，收集更多数据从以验证本工艺是否适宜应用于实际生产中。