园艺植物组织培养中的褐化现象及抗褐化研究进展

丁旭锋 张谈捷

摘 要：褐化是指植物组织培养中常见的细胞生长不良情况，已成为近年来植物组织培养的科研热点之一。文章主要针对我国国内最新研究进展，阐明了细胞褐化现状及其主要机制与产生原因，提出了抑制褐变的有效对策，以供参考。

关键词：植物组织培养；褐化现象；抗褐化研究

文章编号：1005-2690（2023）15-0099-03       中国图书分类号：S60       文献标志码：B

目前，在一些组织培养中常出现细胞褐变现象。褐变主要出现在细胞外植体中，也出现在愈伤细胞亚代、悬浮细胞以及原生质体培养中。褐变物质不但使周围的植物、细胞、培养基等均转为棕色，同时抑制多种蛋白质，影响培养基正常发育与分化，严重时可致死。因此，探讨在植物组织培养工艺中的褐变问题、机制和预防措施，对目前工厂制剂中的植物研究以及植物外组织、原生质体、悬浮菌等培养具有重要的现实意义。

褐变可分为酶促褐变和非酶促褐变，一般认为主要是由酶促褐变而引起的。酶促褐变依靠蛋白酶、接收器和氧气3种物质。构成褐变主要是蛋白质，即多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD），其中PPO是最重要的。褐变是一般正常组织细胞内多酚氧化酶活动的主要产物，其通过氧化酚类化合物而产生褐色觉醒物质。产生褐变的酶大多是酚类化合物。在一般正常的组织细胞内，化学物质、氧气等和PPO的结合不能导致褐变。这主要是因为在一般组织细胞中，多酚主要分布于液泡中，其底物广泛分布于各种质体及细胞浆中。这些区域的分布阻碍了底物和多酚接触，给酶在细菌细胞壁结构发生变化或破坏时到达底物提供了必要条件。在有氧气的情形下，酚类首先被氧化唤醒，再经过脱水处理和聚合过程，最后产生一种导致褐变的深褐色化合物，并由此导致了褐变。

1 褐化现象产生的原因

1.1 非酶促褐变

非酶促褐变是指由于应激障碍或其他不利条件引起的程序性凋亡，或由于坏死引起的细胞褐变，包括酚类化合物的形成。程序性凋亡可能由多种不利因素引起。采取适当措施或愈伤组织适应应激条件，这些细胞的褐变消失。

1.2 酶促褐变

酶促褐变是指由苯酚蛋白酶所催化醌类化合物的聚合物在高氧环境下产生的反应进程。一般植物细胞和培养体的褐色由某些植物的酚类化合物和多酚氧化酶大量产生，特别是木质植物中。一般在成熟的植株细胞内，因为酚类化合物和多酚氧化酶大量单独产生，色素比较稳定。

在切除过程中，周围结构的完整性遭到了严重破坏，同时酚类化合物与多酚氧化酶之间的隔离也受到了损伤，导致大量酚类化合物和多酚氧化酶排出。

另外，多酚氧化酶还将大部分酚类化合物氧化成了土壤棕醌和水。喹诺酮类药物在酪氨酸蛋白酶等蛋白酶的影响下，和外源植物蛋白聚合，引起生长发育停止，最后引起细胞凋亡。

在正常的细胞中，其受底物、氧和PPO的产生均不会引起细菌褐变。这是因为在发育正常的组织细胞中，多酚弥散在正常细菌的液泡中，而PPO则弥散在各种质体的正常细菌胞浆中。这种不同的物理化学分区造成了衬底物与PPO的不相似。当细菌表皮层的物理化学性质被干扰或损伤之后，为酶体与PPO接触创造了条件。在氧气存在的前提下，酚类化合物就会被氧化成醌类，并和醌类产生了一系列脱水的聚合反应，也就随之产生了暗棕色化合物，最后导致细胞褐变。

2 影响褐变的因素

2.1 物种及其基因型

草本植物通常较木本植物不易褐变，因为草本植物通常具有较低浓度的单宁或色素，而酚糖苷为产生木质素、单宁和色素的前体，使草本植物不易褐变。例如，浙江楠中的单宁含量愈高，组织培养就愈难，甚至形成的愈伤组织细胞也易褐变致死。万寿菊的不同种子会有不同程度的褐变。所以在莖尖上培养的植物褐变程度会因种类而异。类似结果也发生在万寿菊及其他园艺作物上。细胞色素含量较高的植物在组织培养中更易引起褐变。

褐变的深度和次数会因植株内酚类化合物浓度和酵素活力的差异而不同。木本植物的酚类化合物浓度大于草本植物。在组织培养过程中发现，草本植物的褐变率较低，而同一株植物不同品种、不同种类的植株褐变率也不同，如浙江楠的茎段易褐变。在实际研究中，杂交育种后的茎段往往只出现较轻度的褐变，而植株的繁殖和外植体上部分也会褐变，这是在育种过程中发生错误的重要因素。

2.2 外植体生理状态

一般褐变随年龄和组织木质化程度的增加而增加，例如在万寿菊培养中，幼体外植体中醌含量低，而成体外植体中醌含量高。研究人员对24种菊花进行茎尖培养发现，冬春两季的褐变死亡率较低，但其他季节的褐变死亡率较高。外植体大小会影响褐变，外植体的衰老程度愈高则外植体木质素浓度也愈高，更易产生褐变现象，而成体材料的褐变往往较雏体材料更为显著。故有的研究者把万寿菊苗的茎尖切开，接种后褐变程度较轻。但随着苗龄增加，褐变现象逐步加剧，尤其成熟树茎尖褐变现象更为严重。外植体的大小主要反映外植体的褐变，小的外植体容易褐变，而大的外植体不容易褐变。一些小万寿菊品种的试验证明，茎尖5～l0 mm的效果较好。同时，狭缝体积越大，氧化中的多酚越多，褐化效应越强。因此，外植体的机械破坏过程对褐化的形成也有很大影响，并且随着机械损伤程度的增加而增加。在浙江楠叶片诱导过程中，整批叶片的褐变率低于多片叶片的褐变率。除了机械损伤外，所有用于杀菌的生物制剂也会导致外植体变黄。酒精杀菌对外植体的损伤更大，容易导致物种灭绝。不容易发生褐变的生物体，用氯化汞杀菌后通常不发生褐变，但用次氯酸钠杀菌就容易发生褐变，而且杀菌效率远低于次氯化汞[1]。

2.3 培养条件

从野外暴露在自然光下的植物中提取的万寿菊尖端接种后会变黄。例如，在切割外植体之前的遮阳或分叉有助于减轻褐变，但由于在酚类化合物的合成与氧化过程中，酶系统的部分活力也是由光诱导的。另外，光在组织培养过程中促使酚类产物氧化。而光照条件对菊花叶片分泌的影响，主要有黑暗、漫射光、短昼和长昼。所以，在暗或弱的光照下栽培一段时间有助于降低植株的褐变率。

初级育种品种接种后在黑暗环境中培养，对褐变有一定的控制作用，但效果远不如接种前的预处理。褐化的原理是整个氧化过程由酶系统控制，酶系统的活性也受光的影响。但必须注意的是，长期的暗培养会降低外植体的活力，甚至引起细胞凋亡，但是正确的时机还有待检验。

温度对褐变的影响较大，15～25 ℃温度环境培养比25 ℃以上培养的褐变较轻。据相关研究，在15～25 ℃温度环境培育的万寿菊的褐变比25 ℃以上培育的要低。在7 ℃温度下培育景宁榕皮尖的褐变比15 ℃和30 ℃温度下的低，这说明高温能够促进酚型的氧化，而低温能够控制酚型受质氧化。多酚氧化酶活力下降，产生了轻度碱褐变。2016年王明华教授等也证实了低温环境对褐变严重的菊科种类有控制褐变的效果。

2.4 培养基及培养方式

培养基内糖的丝氨酸含量过多会导致细胞褐变。但在同样含量下，蔗糖对褐变的抑制作用高于葡萄糖。矿物质成分影响褐变。在蝴蝶兰的1代中，若培养基中Fe3＋和Cu2＋的含量越高，则褐变就越明显，即Fe3＋和Cu2＋都能作为催化剂促进多酚和单线态氧（ROS）反应，从而被氧化成醌类。在万寿菊愈伤组培养基上，由于氮源的配比错误可能会导致细胞褐变。在由万寿菊愈伤细胞所诱导的继代种培育工程中，培养基pH值改变可以导致酚类和酚氧化酶结合部位的改变，进而降低多酚的抗氧化能力。因此，随着6-BA浓度增加，万寿菊培养中腋芽外植体的褐变和死亡数量会增加。在培养基中加入抗氧化物质可以有效减少褐变，如在浙江楠愈伤组织培养基中添加抗坏血酸250 mg/L、亚硫酸钠250 mg/L、柠檬酸5 000 mg/L，可以有效降低褐变；如果将1/2的配合物质添加到带芽槭芽增殖培养基中，可以有效降低污染度和褐变。在蝴蝶兰无菌苗培养基中加入200 mg/L的谷胱甘肽，对蝴蝶兰植株的分化生长和控制褐变均有较好的综合作用；而Vc和硫代硫酸钠对褐变有较强的抑制作用，并且可控制外植物的生长发育与分化；高活性碳材料对控制褐变有很强的综合作用，并对植物分化生长也有一定的抑制作用[2]。

不同的培养方式产生不同程度的褐变。增加愈伤细胞和培养基接触上的给氧能力可以控制褐变，降低产生多酚的外植材料周围的多酚也可以降低褐变率。针对不同的种类，可以控制褐变的培养基方式不同。因此用滤纸或在珍珠岩基质培育万寿菊的效果良好；浙江楠的液体培养基有助于降低外植体的褐变。在万寿菊培育上，将烧瓶旋转10～15 d并更换新鲜培养基，可以显著降低褐变率。在桑椹培养中，转移期15 d时褐变率为9％，转移期30 d时褐变率为64％。

3 防止褐变的措施

3.1 选择适宜的培养基

一是调整介质中无机离子的种类和浓度。改性诱导培养基中，未改性诱导培养基效果较好，降低了Browning死亡率。使用改良的介质可以减轻褐变现象。二是改变了培养基内激素的含量与水平。外源融激素在较低浓度时可降低或引起褐变性。在培养基中加入抗氧化剂，常用的有抗坏血酸、硫代硫酸钠、人血白蛋白等。培育工程中，在培养基中加入抗坏血酸可以有效防止细胞污染。在万寿菊组织培养中加入抗氧化剂可以有效防止万寿菊褐变。三是在介质中加入吸附剂。对于酚氧化物的吸收必须选择较低浓度的活性炭，由于活化炭吸附力较强，所以活性炭材料更易于吸收酚氧化物。由于对活性碳材料的吸收没有选择性，多酚氧化物的营养物质能被迅速吸收。因此，在蝴蝶兰的组织培养中，活化碳可以控制蝴蝶兰生长发育，但不能将其分离。在组织培养中存在水解多酚，在这种外植体的培养中，多酚会释放，并在培养基中逐渐变暗，且氧化成醌。多酚和醌之类的化合物控制酶的活力，因而可以控制从外植体中吸收的养分[3]。

3.2 选择合适的外植体

大量科学研究证实，选用适宜的外植体和栽培条件是克服褐变的主要方法。外植体上必须具有强大的分生组织功能。在良好的细胞再分化和再分化环境下，外植体增殖旺盛，因此也大大减少了褐变。而在适宜的高温和全黑暗环境下，外植体的褐变可明显减少。经研究，外植体的酚氧化在暗培养或150 lx射线强度下被抑制，如在初始芽培养7～42 d，对于易发生褐变的材料，接种后旋转时间过长、创面周围醌类增多，会加剧材料的褐变[4]。

3.3 加入抗褐化剂、吸附剂

抗氧化剂与其他抑制剂除了可以有效控制酶促褐變Vc外，同样是一种多氢氧基的还原产物。一方面，可以灭活多酚氧化酶，控制多酚物质氧化过程。另一方面，Vc在酶的催化下可以消耗大量溶解氧，使多酚化合物不会由于缺氧而氧化。在培养基中添加Vc能够有效避免褐变。因此抗氧化剂的品种与含量对于防止银杏褐变起关键作用。同时，通过活性炭吸附物和Vc的组合，能够有效预防除香蕉茎尖以外植株其余部分的褐变。在继代培养基中加入Vc 0.2 mg/L也能有效降低愈伤组织褐变率。

常见的吸收物质是活性碳塑料和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。其中，活性碳塑料是一种吸附性较好的无机吸附剂，能够吸收培养基内的有害物质，如琼脂培养基内的蛋白质、培养体分泌的酚型、蔗糖中经高温消毒的醌类和五-羟甲基糠醛等，并促进培养体正常繁殖。在实际的应用环境中，要注意使用最低浓度的活性碳，以抵抗土壤褐变的风险，因为对活性碳的吸收没有选择性，在吸附物质的同时，也会吸收介质中的某些物质，对诱导外植物的细胞分化也有一定影响。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是一类独特的酚型活性碳吸附剂，是生物化工的研究中酚类化合物和细胞器分开的保护物，是一种针对酚类化合物的专用吸附物。结果显示，PVP对牡丹花茎中离体心肌细胞所产生的细胞内褐变有很强的抑制作用，而且随着含量提高，抑制作用更加突出。但是一些试验也表明，PVP并没有完全防止褐变，因为植株中存在不同的酚类化合物，所以PVP也会有不同的分子数目类型[5]。

4 结束语

目前，我国对多酚类化合物在活细胞内生物动态代谢机制及其对蛋白质组成影响等方面的应用研究较少。因此，促使人们确定并研究引起褐变的多酚类型，研究其对细胞有害的生物机制，从根本上找到合理的解决方案，形成一个完整的体系。

参考文献：

[1]林英，司春灿，赖远东，等.纳米材料对植物组织培养的影响及在植物组织培养上的应用[J].景德镇学院学报，2022，37（6）：40-42，61.

[2]吴港圆，杨雅钧，何石燕，等.植物组织培养技术研究进展[J].壮瑶药研究，2022（1）：74-79，238-239.

[3]张梅，杨燕，盛鹏，等.植物组织培养中褐化现象控制方法分析[J].种子科技，2022，40（3）：91-93.

[4]张玮雨.植物组织培养褐化现象研究进展及防治方法[J].农村经济与科技，2017，28（14）：38.

[5]曾镭，刘燕.植物组织培养中褐化问题的研究进展[J].安徽农学通报，2007，13（14）：49-50，152.