基于网络药理学分析探讨槟榔促进口腔黏膜下纤维化的活性成分及其潜在分子作用机制

冯奕晨

（兰州大学 口腔医学院，甘肃 兰州 730030 ）

口腔黏膜下纤维化（oral submucous fibrosis,OSF）是一种常见口腔癌前病变，临床上的症状包括灼痛、口干、吞咽困难、进行性张口受限等。不同地区OSF 的发病率有明显差异，一般于0.04%～24.40%不等。而在南台湾的土著居民中，咀嚼槟榔物的流行率约为69.5%［1］。在口腔癌患者中，口腔癌常与OSF 纤维性变并存［2］。OSF 在我国内陆地区主要发生于湖南、海南及台湾等地，与当地居民生活饮食习惯密切相关。谢赛飞等［3］近期就曾发表过中药药方通过Wnt/β-catenin 信号通路对OSF 的调控作用研究。尽管如此，OSF 的致癌率仍趋于高发，且临床缺乏有效控制手段，尚未见槟榔致OSF 的具体机制研究。

槟榔是棕榈科槟榔的种子，全世界槟榔咀嚼者约6 亿～12 亿［4］。经常咀嚼含烟草的槟榔制品与诸如OSF、白斑等口腔癌前病变的发生之间的关系已经得到肯定。槟榔碱是槟榔的活性成分，具有毒性，在从槟榔分离出的生物碱中含量最高。此外，从槟榔分离出的生物碱还包括少量去甲基槟榔次碱和槟榔次碱及含量更少的槟榔副碱、异去甲基槟榔次碱和去甲基槟榔碱等。槟榔碱是强碱性油状液体，无色无臭，易溶于水、酒精及部分有机溶剂，能随水蒸气挥发［5］。

通过建立新型“疾病-基因-靶点-药物”协同研究网络，网络药理学从整体的角度揭示药物对机体的复杂作用和药物对疾病的干预机制［6］。该方法所具有的系统性恰好契合生物提取物作用的协同性、整体性等特点［7］。近年来，口腔领域研究也逐渐应用网络药理分析方法探讨相关机制。顾磊等［8］应用网络药理学预测了白花蛇舌草中353 个相关靶点，并发现25 条相关作用通路与口腔癌治疗密切相关，功能方面则证实白花蛇舌草与口腔癌的细胞凋亡，增殖，炎性反应及氧化应激等多个生物过呈密切相关。本研究旨在通过网络药理学筛选出槟榔促进OSF 的主要有效成分、潜在的复杂关系网络和主要的作用核心靶点，为揭示槟榔致病机制提供科学参考，为探究OSF 癌变的预防和靶向治疗提供新途径和可靠理论基础。

1 方法

1.1 筛选活性成分

以“Arecae Semen”（槟榔）为关键词在中医药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.Php）进行查找。随后设置参数标准为药物相似性（DL）≥0.18，口服生物利用度（OB）≥30%，对槟榔的活性成分展开筛选。

1.2 筛选靶点

1.2.1 预测槟榔活性成分的靶点 经过与靶点的相互作用，药物活性成分才能够发挥其生物功能，于是本研究采用TCMSP 数据库查找槟榔活性成分潜在的作用靶点，接着采用SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）数据库，对结果开展标准化匹配。

1.2.2 筛选OSF 靶点 本研究通过在DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库中输入“oral submucous fibrosis”来得到有关的非重复靶点。

1.2.3 分析OSF 相关的药物活性成分靶点 将药物活性成分相关靶点与疾病相关靶点进行比较，取交集，最后得到OSF 相关的药物活性成分靶点，待后续讨论分析。

1.3 建立蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和成分-靶点（C-T）网络

1.3.1 PPI 网络 借助String 数据库（https：//string-db.org/），探究OSF 相关的药物活性成分靶点，建立靶点蛋白间的互做网络关系。随后，通过对PPI 网络图的拓扑分析深入研究核心靶点，详见材料方法“1.4”项。

1.3.2 C-T 网络 采用Cytoscape 3.8.2 软件将药物活性成分与核心靶点进行联系，建立药物活性成分与核心靶点的关系网络图，再进一步探究起主要作用的药物活性成分。

1.4 网络拓扑分析

打开Cytoscape 3.8.2 软件并导入材料方法“1.3”项建构的PPI 网络分析结果，根据“度”“度介中心度”和“接近中心度”这三个主要参数对网络拓扑结构进行分析，再筛选其中的核心靶点网络。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

登陆DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），导入疾病相关的药物活性成分靶点，对其进行GO 与KEGG 富集分析。随后将前20 个GO/KEGG 结果归类展示。信号通路中各种靶点与相关药物成分的药理作用关系越密切，则结果显示的FDR 数值越高。

2 结果

2.1 活性成分

TCMSP 数据库中可以检索到52 个与槟榔相关的化合物成分。按照DL≥0.18 以及OB≥30%的参数标准，最终筛选出5 个活性成分。见表1。

表1 槟榔相关活性成分

2.2 靶点的筛选

依据化学结构的相似性筛选5 个槟榔活性成分靶点，共得到213 个活性成分相关的靶点。在GeneCards 和DisGeNET2 数据库中得到与OSF 有关的疾病靶基因，再通过整合数据库除去重复靶点，最终得到596 个OSF 的相关靶点。然后通过对疾病靶点与药物活性成分靶点的结果取交集，得到31 个OSF 相关的药物活性成分靶点（见图1），待后续进行分析。

图1 药物-疾病交集基因

2.3 PPI 网络和核心靶点分析

为了更好地理解槟榔对OSF 的作用机制，借助String 数据库构建PPI 网络，再把PPI 网络上传至Cytoscape3.8.2 软件，绘制互作网络图（见图2）。31 个核心靶点分别为TERT、TP53、MMP2、MMP9、VEGFA、PTGS2、EGFR、HIF1A、ACE、KIT、MMP3、MDM2、MPI、BCL2、MAPK1、KRAS、MMP8、MAP2K1 等（见图3）。

图2 核心基因网络互作图

图3 PPI 对接图

2.4 GO 功能富集

GO 功能富集获得槟榔作用生物学过程，根据FDR≤0.01 的标准进行筛选后对前20 条显著的生物学功能进行做图展示，主要包括细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖和炎症反应4 个方面（见图4）。具体涉及的功能包括：①细胞对缺氧的反应；②基因表达的正向调控；③MAPK 级联正调控［9-10］；④细胞外基质分解。基于以上4 个主要方面可以看出，槟榔对OSF 促进作用可能是一个复杂的多途径协同作用的结果。

2.5 KEGG 通路富集

KEGG 通路富集能对已筛选出的31 个靶点开展分析，其目的是揭示槟榔对OSF 的潜在促进作用机制。本研究根据FDR≤0.01 的标准，筛选得到KEGG 信号通路。其中前20 条中跟癌症有关的信号通路涉及：①内分泌代谢；②中枢代谢；③PI3K-Akt［11-13］等（见图5）。

图5 KEGG 基因通路富集分析

3 讨论

其中多个基因与口腔癌前病变的恶性转化密切相关，如原癌基因MDM2 已被证实与OSF 的癌变过程相关联，尹晓敏等［14］通过免疫组织化学法检测对比OSF 组织、OSF 癌变组织及正常口腔黏膜组织中MDM2 蛋白的表达及分布发现，MDM2蛋白在正常口腔黏膜中呈阴性表达，在OSF 及OSF 癌变组织中阳性表达率逐渐增加，OSF 组及OSF 癌变组织组显著高于正常对照组。

基因靶点MMP-2/-9 是癌细胞迁移和入侵所必需的，在癌细胞的转移（迁移和入侵）中具有重要作用。PENG 等［15］发现石榴提取物（POMx）可以抑制口腔癌细胞的转移。基于口腔癌HSC-3 和Ca9-22 细胞的酶图和MMP-2/-9 的Western 印迹分析，口腔癌细胞的POMx 抑制性迁移可以通过MMP-2/-9 的失活来实现。这表明MMP-2/-9 的表达是口腔癌细胞转移的重要影响因素之一。

人类癌症中最常发生突变的基因是p53（TP53）。李怀奇等［16］采用免疫组织化学染色法检测HPV16E6 和p53 在不同组织中的表达，发现p53 在口腔癌中的阳性表达率为23.7%，在癌前病变中的阳性表达率为57.1%，在癌周正常组织中的阳性表达率为89.9%，口腔癌中p53 的阳性表达率显著低于癌前病变与癌周正常组织。得到结论：p53 基因的表达抑制在癌症病变的过程中具有重要意义。

基于KEGG 通路富集分析可知，PI3K-Akt 是口腔癌的发生发展的重要干预通路，多个研究亦证实其作为关键靶点的意义及价值。王璞等［17］探讨细胞周期蛋白B1 基因对口腔癌增殖，侵袭和迁移的影响及作用机制。研究发现敲低细胞周期蛋白B1 表达的细胞增殖、侵袭和迁移能力及MMP-2、MMP-9、PI3K、p-Akt 蛋白表达均明显低于对照组（P＜0.05），两组间Akt 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。获得结论：口腔癌的干预和发展的作用机制可能与抑制PI3K/Akt 信号通路的激活有关。

综上所述，OSF 是一种口腔潜在恶性疾患，这意味着患者需要长期监测疾病进展情况，进行定期随访以预防癌变的发生，或尽早发现癌变和治疗癌变。患者初诊时须根据病变范围、严重程度等因素选择适宜部位取活检，明确组织病理学诊断，对于伴发口腔鳞状细胞癌者应早期采取外科治疗。综上所述，本研究基于网络药理学的模式，预测了槟榔的活性成分及相应的作用靶点，对其促进诱导OSF 转化成癌的潜在分子机制进行了分析。槟榔对OSF 的作用是多靶点、多途径、多化合物共同作用的结果。将来的研究中，本人会更深入探究槟榔中不同化学成分的代谢机制和相互协同作用，为揭示槟榔致病机制提供科学的参考，为治疗OSF 疾病提供可靠的理论基础。