甲维盐提纯工艺优化研究

王鸿发，郭佳，李芳，王少云

(宁夏泰益欣生物科技股份有限公司，宁夏 银川 750205)

0 引言

甲胺基阿维菌素苯甲酸盐(简称“甲维盐”)是以阿维菌素为初始原料进行合成的一种新型抗生素，其主要成分包括甲胺基阿维菌素苯甲酸盐Bla 和Blb 的混合物。颜色为淡黄色、白色结晶粉末。易溶于丙酮、乙醇、甲醇等极性溶剂，微溶于水，水中溶解度(20 ℃，pH=7.0)0.024 g/L，(20 ℃，pH=3.0)0.003 g/L，不溶于己烷。在常温常压下，甲维盐的稳定性较好，对热不敏感，但在强酸、强碱、强光、强氧化剂的极端条件下不稳定。甲维盐作为阿维菌素半合成衍生物，其结构与阿维菌素类似，但生物活性相比阿维菌素提高了1～3 个数量级。尤其是对鳞翅目害虫、稻纵卷叶螟等活性极高。在蔬菜、水稻等大田农作物中应用更为广泛，已有报道显示，甲维盐主要的杀虫方式有胃毒和触杀，即当生物体接触该药后，可通过渗透作用进入微生物体，发挥药效，达到杀虫的目的。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

YP4002 电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；waters2487 型HPLC(江苏塞恩斯科技有限公司)；HK-3C 型酸度计厂家为北京海富达科技有限公司，HS-DHG 电热恒温鼓风干燥箱(上海和晟仪器科技有限公司)；pH 计；温度计。

1.2 试剂

甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、乙酸异戊酯、盐酸等试剂均由天津市凯通化学试剂有限公司提供分析纯试剂。

2 材料与方法

2.1 材料

甲维盐粗品由宁夏泰益欣生物科技股份有限提供。

2.2 方法

2.2.1 实验方法

溶解：精准称量甲维盐粗品适量，选用水、甲醇、乙醇、丙酮等溶剂进行溶解；

萃取：以甲维盐粗品的溶解液进行实验，筛选乙酸乙酯、石油醚、乙酸异丙酯等溶剂中最佳萃取剂，同时筛选萃取压力、萃取时间和萃取温度对甲维盐纯度和收率的影响；

分离：加入萃取剂的甲维盐溶液经充分搅拌后静置分层，筛选对甲维盐收率和纯度影响最小的分离压力及分离温度，分离所得萃取液；

结晶：将萃取液进行蒸发浓缩结晶，获得甲维盐成品。

2.2.2 检测方法

采用单因素分析方法探究各因素对甲维盐收率及含量的影响，并建立了HPLC 法测定甲维盐的含量。色谱条件：WondaSil C18-WR 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为水-乙腈(3∶7)；流速1.0 mL/min，波长为280 nm。

3 结果与分析

3.1 溶解剂对甲维盐纯化的影响

甲维盐在纯化过程中需要先进行溶解，而不同溶剂对甲维盐的溶解程度存在较大的影响。因此，在其他条件不变的情况下，考察水、甲醇、乙醇、丙酮等溶解剂的溶解效果，筛选最优溶解剂。具体结果如图1所示。

图1 溶解剂对甲维盐收率和含量的影响

由图1 可知，溶解剂中乙醇和丙酮对甲维盐的收率和纯度影响较大，其中丙酮作为溶解剂时，甲维盐的收率和纯度均为最大值，但由于丙酮挥发性强、具有坚强的毒性，对人体有害，而乙醇为常见试剂，对人体的危害较小，安全系数高，因此，可以选择乙醇作为溶解剂。

3.2 萃取溶剂对甲维盐纯化的影响

萃取是采用一种溶剂将甲维盐溶液中的甲维盐溶解，分层并分离获得甲维盐萃取液，但是不同的萃取溶剂对甲维盐的溶解效果存在较大的差异。筛选一种较好的萃取剂可以有效提升甲维盐的纯度。本次实验筛选萃取剂为乙酸乙酯、乙酸异丙酯、石油醚。具体结果见图2。由图2 可知，本研究所用的三种萃取剂所得的甲维盐的收率基本持平，但含量差异较大，乙酸乙酯的含量达到最大值，因此，以乙酸乙酯为萃取剂进行后续条件筛选的单因素实验。

图2 萃取剂对甲维盐收率和含量的影响

3.3 萃取压力对甲维盐纯化的影响

萃取过程中，压力的变化能够影响萃取的结果，也可以对甲维盐成品结果产生影响，因此，称取适量的甲维盐粗品，共设8 个压力梯度，分别为5 Pa、10 Pa、15 Pa、20 Pa、25 Pa、30 Pa、35 Pa、40 Pa，其余条件不变的情况下进行实验。具体结果见图3。

图3 萃取压力对甲维盐收率和含量的影响

由图3 可知，随着萃取压力的逐渐变大，甲维盐纯度和收率均为上升的趋势，当萃取压力小于30 Pa时，无论是甲维盐的收率还是纯度，都比较小，提纯效果差；当萃取压力增大到30 Pa 时，提纯效果较佳，当萃取压力在30～40 Pa 之间时，收率和纯度的变化基本保持平稳，因此，萃取压力可以确定为30～40 Pa。由于萃取压力为30 Pa、35 Pa、40 Pa 时，提纯效果几乎没有发生变化，如果从安全和经济成本角度考虑，可以选择低压力30 Pa。

3.4 萃取温度对甲维盐纯化的影响

称取适量的甲维盐粗品，加入乙醇溶解剂，用乙酸乙酯进行萃取，萃取压力分别为30 Pa，萃取温度分别设置为20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50℃、55℃，其他条件不变的情况下进行单因素验证实验。具体结果见图4。

图4 萃取温度对甲维盐收率和含量的影响

由图4 可知，萃取温度对提纯效果的影响小于萃取压力。萃取温度在40 ℃以下时，萃取效果较差；当温度增大到40 ℃时，萃取效率明显增大；当温度增大到40 ℃时，萃取效果最佳，继续增大温度，收率和纯度都逐渐减小，这可能是由于高温对甲维盐的结构造成了影响，导致小部分甲维盐发生化学反应，生成其他物质。因此可以选择40 ℃左右的萃取温度。

3.5 萃取时间对甲维盐纯化的影响

在生产过程中，萃取时间的长短对纯度、收率和产量均有直接影响，萃取时间短，可能会导致萃取不彻底，影响收率和纯度，萃取过程消耗的时间长，可能造成时间的浪费，影响最终的进度和产量，因此称取适量甲维盐粗品，用乙醇溶解，加入乙酸乙酯萃取，萃取压力为30 Pa，萃取温度为40 ℃，设置7 个萃取时长进行验证，分别为1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h。具体结果见图5。

图5 萃取时间对甲维盐收率和含量的影响

由图5 可知，萃取时长小于2.5 h 时，甲维盐的收率和纯度随着萃取时间的延长而提高，增大幅度显著；当萃取时长大于等于2.5 h 时，随着萃取时间的延长，收率和纯度基本趋于稳定，综合各生产因素，萃取时间确定为2.5 h。

3.6 分离压力对甲维盐纯化的影响

称取适量的甲维盐粗品，用乙醇溶解，加入乙酸乙酯萃取，萃取压力分别为30 Pa，萃取温度为40 ℃，共设置7 个分离压力，分别为0.1 Pa、2 Pa、4 Pa、6 Pa、8 Pa、10 Pa、12 Pa，萃取时间为2.5 h，其余条件不变进行单因素实验。具体结果见图6。

图6 分离压力对甲维盐收率和纯度的影响

由图6 可知，分离压力为4 Pa 时，效果最佳，当分离压力小于4 Pa，收率增大，甲维盐纯度下降，这可能是由于分离的样品中含有一部分杂质；当分离压力大于4 Pa 时，收率和纯度都有所下降，这可能是流体中一部分甲维盐没有在分离釜中彻底分离。由于分离压力对提纯结果影响较小，因此在后续的正交试验中分离压力可以取4 Pa。

3.7 分离温度对甲维盐纯化的影响

称取适量的甲维盐粗品，用乙醇进行溶解，加入乙酸乙酯萃取，萃取压力为30 Pa，萃取温度为40 ℃，分离压力为4 Pa，萃取时间为2.5 h，分离温度分别设置为20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃进行验证。具体实验结果见图7。

图7 分离温度对甲维盐收率和纯度的影响

由图7 可知，在其他条件不变时，随着温度的提升甲维盐的纯度和收率呈先上升后下降的趋势，当分离温度在40 ℃时，甲维盐的收率和纯度达到峰值，依据最优值选择，分离温度确定为40 ℃。

3.8 工艺稳定性实验

通过以上单因素实验，确定了甲维盐纯化过程中的7 个参数，具体工艺参数如下：溶解剂为乙醇，萃取剂为乙酸乙酯，萃取压力为30 Pa，萃取温度为40 ℃，萃取时间为2.5 h，分离压力为4 Pa，分离温度为40 ℃。以所得最优工艺进行5 次重复实验，验证其工艺的稳定性。

由表1 可知，5 次平行试验得到的甲维盐平均收率在80.18%；甲维盐B1 纯度平均值为94.06%。5 次平行实验的相对标准偏差分别为0.08%和0.11%，相对标准偏差均较低，表明该工艺合理可行。

表1 工艺稳定性验证

4 结论

本研究通过对甲维盐纯化过程中的溶解剂、萃取剂、萃取压力、萃取温度、萃取时间、分离压力和分离温度等参数进行了优化，结果表明，每个单因素实验中最适参数对甲维盐收率、纯度均有影响，通过此工艺稳定性验证，甲维盐纯化后的收率达到80.18%，纯度达到了94.06%。能够萃取压力为30 Pa，萃取温度为40 ℃，分离压力为4 Pa，分离温度为40 ℃，萃取时间为2.5 h，其他参数若需要精确细化可继续进行实验。