无创产前基因检测在胎儿染色体非整倍体检测中的应用价值

黄萍华 唐萍 周赤燕 高丹苑 王建国 祝建军

目前，我国每年新增的出生缺陷胎儿数约为90 万[1]。胎儿出生缺陷的主要原因之一为染色体异常，在新生儿中发生率约0.5%[2]。常见的染色体异常包括13-三体综合征、18-三体综合征、21-三体综合征和性染色体异常[3]。因此，染色体异常是产前筛查中的重要检查内容。目前，血清学筛查是进行孕妇产前筛查的主要方法，但其检出率低且假阳性率高[4]。通过介入性产前诊断进行染色体核型分析是诊断胎儿染色体异常的“金标准”[5]，但存在早产、流产、宫内感染等风险[6]。1997 年，Lo 等[7]发现胎儿游离DNA 存在于孕妇外周血中，基于此开辟了无创产前基因检测（noninvasive prenatal test，NIPT）。NIPT 通过高通量测序技术快速检测孕妇外周血中的胎儿游离DNA，已被广泛用于临床诊断胎儿染色体异常情况[8]。本研究通过染色体核型分析和染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA），探究NIPT 在胎儿染色体非整倍体检测中的临床应用价值。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2017 年至2022 年在嘉兴市妇幼保健院产前诊断中心接受NIPT 的孕妇35 531 例，孕周12～32 周，孕龄17～49 岁。本研究经本院医学伦理委员会审查通过[批准文号：2023 产前伦（快）-1]，所有孕妇均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 采集孕妇空腹外周静脉血5 mL，置于乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝管中，4 ℃、2 000 r/min 离心10 min，分离血浆存放于-80 ℃冰箱。

1.2.2 文库构建与测序 按照胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒说明书（华大生物科技武汉有限公司）进行操作，提取孕妇外周血胎儿游离DNA，并对游离DNA 特定序列接头连接、扩增，采用NIPT 进行测序。将测序所得序列比对人类基因组参考序列图谱，检测13/18/21-三体综合征、性染色体异常以及其他染色体异常。

1.2.3 染色体核型分析 对NIPT 提示为高风险且自愿进行介入性产前诊断检测的孕妇，行羊膜穿刺术或脐血穿刺术进行染色体核型分析或CMA。

1.2.4 CMA 检测 按照CMA 应用生物系统检测试剂盒（美国赛默飞世尔科技）说明书步骤检测基因组DNA 的拷贝数变异和杂合性丢失。

2 结果

2.1 NIPT 筛查结果 35 531 例孕妇中，共检出染色体非整倍体高风险孕妇512 例（1.44%）。其中13-三体综合征高风险36 例，18-三体综合征高风险46 例，21-三体综合征高风险114 例，性染色体异常135 例，其他染色体异常181 例，见表1。

表1 NIPT 检出染色体非整倍体高风险类型的组成情况（例）

2.2 NIPT 与染色体核型诊断结果比对 NIPT 提示高风险的512 例孕妇中，448 例接受羊水穿刺，检测出与NIPT 提示结果相符的染色体核型异常孕妇204 例，符合率为45.54%。经染色体核型分析，与NIPT 结果相符的13-三体综合征7 例，符合率为21.21%（7/33）；与NIPT 结果相符的18-三体综合征17 例，符合率为45.95%（17/37）；与NIPT 结果相符的21-三体综合征99例，符合率最高，为95.19%（99/104）；与NIPT 结果相符的性染色体异常55 例，符合率为47.41%（55/116）。此外，与NIPT 结果相符的其他染色体核型异常26 例，符合率为16.46%（26/158）。

NIPT 提示高风险的512 例孕妇中，214 例同时进行CMA，检测出与NIPT 结果相符的CMA 结果异常孕妇88 例，符合率为41.12%。其中，21-三体综合征的符合率最高，为95.83%（23/24）；13-三体综合征的符合率为30.77%（4/13）；18-三体综合征符合率为44.44%（4/9）。此外，NIPT 提示为性染色体异常的61 例中，与NIPT 结果相符的性染色体异常26 例（42.62%）。NIPT提示为其他染色体异常的107 例中，与NIPT 结果相符的其他染色体异常31 例（28.97%），见表2。

表2 染色体非整倍体高风险孕妇的羊水染色体核型分析和CMA 分析结果

2.3 其他染色体异常的介入性产前诊断 在NIPT 提示为其他染色体异常的孕妇中，99 例孕妇选择同时进行染色体核型分析和CMA 分析。经NIPT 提示为其他染色体存在缺失的26 例中，5 例与染色体核型分析结果相符，其余21 例核型正常，符合率为19.23%。14 例与CMA 结果相符，符合率为53.85%；余下12 例不相符的结果中，1 例NIPT 提示为13 号染色体存在缺失，而CMA检测为20 号、5 号染色体存在缺失，其余11例CMA 结果未见异常，见表3。

3 讨论

21-三体综合征、18-三体综合征及13-三体综合征是最常见的胎儿染色体畸变。目前，传统的血清筛查对这3 种疾病的检出率约85%～90%，但存在约10%的假阳性率[9-10]。而染色体核型分析和CMA 虽被认为是产前诊断的“金标准”，但存在流产、胎儿宫内感染的风险，部分应检高风险孕妇难以接受[1，11]。随着医学检验技术的发展，NIPT 因其安全、快速、无介入性，且具有较高的灵敏度和较低的假阳性率被广泛应用于临床[12]。本研究中，在35 531 例选择接受NIPT 的孕妇中，共检出512 例（1.44%）染色体异常高风险，检出率与先前报道的统计数据基本一致[11，13]，包括13/18/21-三体综合征196 例，性染色体异常135 例，其他染色体异常181 例。

国内外研究提示NIPT 作为一种精准的筛查手段，对于13/18/21-三体综合征的检出率较高，但对于性染色体和其他染色体异常的检测具有一定的假阳性率[14-15]。本研究中，为了评估NIPT 筛查染色体异常的准确性。在充分知情同意的情况下，对经NIPT 提示为高风险的孕妇行羊膜腔穿刺术，以进行后续的染色体核型分析和CMA 检测。其中，448 例选择接受染色体核型分析，诊断结果与NIPT 提示结果相符的为204例，包括13-三体综合征7 例，18-三体综合征17 例，21-三体综合征99 例，性染色体异常55 例，其他染色体异常26 例。对比NIPT 和染色体核型分析结果，21-三体综合征的检出符合率最高，为95.19%；13-三体综合征的检出符合率为21.21%，这与目前报道的统计数据基本一致[1，16]。214 例孕妇接受CMA 检测，对比NIPT和CMA 结果，同样的，21-三体综合征的检出符合率最高，为95.83%，13-三体综合征的检出符合率较低，为30.77%。研究表明，CMA具有更高的分辨率（0.1～0.3 Mb），在检测微小染色体畸变方面具有更高的灵敏度和准确性。CMA 能检测全基因组水平染色体拷贝数变异、杂合性缺失等，但无法检测出染色体的平衡易位、倒位、低水平嵌合。相比之下，染色体核型分析能检测出染色体数目异常、大的结构异常、低比例嵌合、平衡性结构重排等，但无法识别＜10 Mb 的异常染色体片段[17-18]。在介入性产前诊断过程中，若同时使用两种诊断技术，能有效避免漏检误检的情况，提高检出率[19]。因此，本研究综合比对了染色体核型分析和CMA 结果，以更好地判断NIPT 筛查染色体异常准确性。结果表明NIPT 对于21-三体综合征的检出符合率极高，几乎可以达到完全检出。而对13-三体综合征和18-三体综合征均存在一定的假阳性率，经NIPT提示为高风险的孕妇需行进一步的介入性产前诊断。综上所述，NIPT 具有较高的21-三体综合征高风险检出符合率，可有效避免有创产前诊断带来的风险，预防胎儿出生缺陷情况的发生。而对于其他染色体异常仍存在较高的假阳性率。因此，在进行NIPT前，应充分告知受检孕妇检测技术的局限性。当NIPT检出为13-三体综合征、18-三体综合征、性染色体异常和其他染色体异常高风险后，应联合采用染色体核型分析和CMA 进行介入性产前诊断以明确诊断，对诊断结果做好遗传咨询并对继续妊娠的孕妇做好随访工作。总之，NIPT 能有效地筛查染色体异常，但也存在一定的假阳性，仍需要不断地优化检测方法。