赤藓糖醇在脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤中的保护作用研究

张曦月 张玉国 罗嫚

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是一种危及生命的疾病，临床表现以弥漫性肺部炎症、肺水肿、肺功能减退、呼吸衰竭为主要特征[1]。目前ALI 的治疗方式主要包括机械通气及药物干预，但由于这些治疗的创伤性及局限性，患者死亡率仍维持在40%左右[2]。近年来，研究发现多种具有抗炎活性及肺保护作用的天然产物对ALI 具有很大的治疗潜力[3]。赤藓糖醇（erythritol，Ery）是一种能够产生抗氧化应激[4]、调节免疫、抗炎[5]等药理作用的多元醇甜味剂，广泛存在于食物中，具有来源广、成本低、易于获取、不良反应相对较小等优势。研究显示，Ery 参与人体的代谢过程，可以通过激活核因子E2 相关因子2 抗氧化能力改善非酒精性脂肪肝[4]，也可以通过调节人体固有免疫功能，减轻代谢紊乱，改善高脂饮食引起的小肠炎症[5]，因此，具有缓解ALI 的潜力。但Ery 是否对ALI 有缓解作用目前尚未见报道。因此，本研究通过构建动物模型，探究Ery 对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠ALI 的保护作用及相关机制，为Ery 用于ALI 的防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 6～8 周龄SPF 级BALB/C 雄性小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2019-0008。所有操作均经吉林大学实验动物福利伦理委员会审查通过（批准文号：SY202204101）。小鼠饲养条件：温度为20～25 ℃，湿度为50%～55%，光照12 h/d，实验动物自由饮水采食。

1.2 主要试剂 Ery 粉末（批号：Z07J7H17429，规格：20 mg，纯度为HPLC≥98%）购自中国上海源叶生物技术有限公司；IL-6 ELISA 试剂盒（批号：B360840）购自美国Biolegend 公司；RIPA 裂解液（批号：S04FD081）购自中国北京康润诚业生物科技有限公司；p65（批号：7）、磷酸化p65（p-p65）（批号：19）抗体均购自美国Cell Signaling Technology 公 司；LPS 粉 末（批 号：0000110640，规格：100 mg）购自美国Sigma 公司；山羊抗兔IgG 抗体（批号：20000758）、BCA 蛋白浓度检测试剂盒（批号：20031437）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；多功能酶标仪（型号：iMark）购自美国Bio-Rad有限公司。

1.3 ALI 模型的构建 采用随机抽签法将40 只小鼠分为空白对照组（NT 组）、药物对照组（Ery 组）、模型组（LPS 组）、治疗组（LPS+Ery 组），每组10 只。Ery 组及LPS+Ery 组小鼠胃部灌注Ery（100 mg/kg Ery 粉末溶于100 μL 0.9%氯化钠注射液），1 次/d，共6 d；NT 组及LPS 组小鼠胃部灌注100 μL 0.9%氯化钠注射液。6 d后，LPS 组及LPS+Ery 组小鼠鼻内滴注LPS（1.25 mg/kg LPS 粉末溶于20 μL PBS）的方法建立小鼠ALI 模型；NT 组及Ery 组小鼠鼻内滴注20 μL PBS。12 h 后，每组随机选取5 只小鼠，颈椎脱臼法处死，获取新鲜肺组织；将每组剩余5 只小鼠麻醉，打开胸腔充分暴露气管，气管切开后后用1 mL 0.9%氯化钠溶液进行肺泡灌洗并回收灌洗液，重复3 次，收集灌洗液后处死小鼠。

1.4 肺组织湿重/干重（湿/干）比值检测 取新鲜的小鼠肺组织（左肺）称重，为湿重。将肺组织放置在80 ℃电热烘干箱内48 h，再次称重，为干重。计算湿/干比值以评价肺水肿的严重程度。

1.5 肺组织损伤评分 将小鼠肺组织（右前叶）固定于4%多聚甲醛中，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，HE 染色。由3 位经验丰富的病理阅片人员根据肺泡腔内中性粒细胞的浸润程度、肺泡的萎缩程度、肺泡腔之间的基质厚度情况等进行肺组织损伤评分。根据损伤的严重程度划分5 个等级，评分为0～4 分（0 分代表无损伤，4 分代表极度损伤）。

1.6 炎症因子检测

1.6.1 肺泡灌洗液中炎症因子IL-6 水平检测 采用ELISA 法检测肺泡灌洗液中炎症因子IL-6 水平。

1.6.2 肺组织中髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性检测 取新鲜的小鼠肺组织（右中叶）放置在2 mL 组织研磨管中，每100 mg 肺组织加入400 μL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，研磨，12 000 r/min 离心10 min后，弃掉上清液，在沉淀中加入等体积的十六烷基三甲基氯化铵溶液，研磨、离心后取上清液。将上清液和工作液依次加入96 孔板中，孵育20 min 后加入终止液，用酶标仪测定450 nm 处吸光度（optical density，OD）值。

1.7 肺组织中炎症相关蛋白p65、p-p65 蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。取新鲜的小鼠肺组织（右后叶）加入RIPA 裂解液，研磨离心后，取上清液进行BCA 定量，每15 μL 样品含蛋白质40 μg。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳后，转聚偏二氟乙烯膜，室温封闭1.5 h，加入待测蛋白抗体（1∶1 000）在4 ℃下孵育过夜。次日，Tris-HCl 缓冲液和TBST 缓冲液清洗后加入二抗（山羊抗兔IgG 抗体1∶2 000）孵育1 h，TBST 缓冲液清洗后进行显色、曝光、成像，应用Image J 计算条带灰度值。

1.8 分子对接 p65 蛋白的三维结构信息来自蛋白质数据库。Ery 信息从PubChem 数据库中获取，并以SDF格式下载。利用AutoDock 工具模拟计算p65 和Ery 之间存在氢键的氨基酸残基，最后使用PyMOL 软件对结果进行可视化。

1.9 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0 统计软件。计量资料组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4 组小鼠肺组织病理损伤情况比较 与NT 组比较，Ery 组小鼠肺组织没有破坏；LPS 组小鼠肺组织肺泡间隙增大，可见炎细胞浸润，肺泡塌陷；与LPS 组比较，LPS+Ery 组小鼠肺损伤程度明显减轻，见图1A。与NT 组比较，LPS 组小鼠肺组织损伤评分升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与LPS 组比较，LPS+Ery 组小鼠肺组织损伤评分降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1B。

图1 4 组小鼠肺组织病理损伤情况比较（A：4 组小鼠肺组织病理切片所见，HE 染色，×200；B：4 组小鼠肺组织损伤评分比较；与NT 组比较，aP＜0.05；与LPS 组比较，bP＜0.05）

2.2 4 组小鼠肺组织湿/干比值比较 与NT 组比较，LPS 组小鼠肺组织湿/干比值升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与LPS 组比较，LPS+Ery 组小鼠肺组织湿/干比值降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 4 组小鼠肺组织湿/干比值比较

2.3 4 组小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平和肺组织中MPO 活性比较 与NT 组比较，LPS 组小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平及肺组织中MPO 活性均增高，LPS+Ery 组小鼠肺组织中MPO 活性增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与LPS 组比较，LPS+Ery 组小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平及肺组织中MPO 活性均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3。

图3 4 组小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平和肺组织中MPO 活性比较（A：4 组小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平比较；B：4 组小鼠肺组织中MPO 活性比较）

2.4 4 组小鼠肺组织中p-p65 蛋白表达水平比较 与NT 组比较，LPS 组小鼠肺组织中p-p65 蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与LPS 组比较，LPS+Ery 组小鼠肺组织中p-p65 蛋白表达水平下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 4 组小鼠肺组织中p-p65 蛋白表达水平比较（A：蛋白表达的电泳图；B：蛋白表达水平比较）

2.5 Ery 与p65 蛋白的分子对接模拟 应用生物信息学技术将Ery 分子与NF-κB p65 蛋白进行对接模拟，结果显示Ery 和p65 蛋白的结合能为-2.18 kcal/mol，结合能＜0，差异有统计学意义，且Ery 与p65 蛋白的氨基酸残基ARG-246、GLN-247 具有氢键相互作用，见图5（插页）。

图5 Ery 与p65 蛋白的分子对接模拟

3 讨论

ALI 是一种危重的临床综合征，临床表现为重度呼吸困难、呼吸急促、氧疗难治性发绀、肺顺应性降低及胸部X 线表现为弥漫性肺泡浸润[6]。导致ALI 的因素有很多，可由肺炎、误吸等肺内因素，也可由脓毒症、创伤等肺外因素引起，而肺炎是其最常见最直接的致病因素[2]。研究表明，革兰阴性菌感染是ALI 最重要的原因之一，LPS 是革兰阴性菌外膜的主要成分，可导致肺损伤和炎症反应[7]。鼻内滴注LPS 常用于构建ALI 模型，可有效诱导中性粒细胞炎症反应，加重肺组织损伤。因此本研究采用该造模方法，成功构建了ALI 模型。

ALI 的发病机制复杂[1]，治疗手段有限。目前临床上治疗主要以机械通气为主，但不恰当的机械通气也可加速急性呼吸窘迫综合征的发展和恶化。因此，寻找有效治疗ALI 的药物至关重要。天然产物由于其易获得、不良反应小且具有广泛的药理活性等优点，近年来备受关注。Ery 是一种具有多种生物功能的多元醇甜味剂，天然存在于水果（如葡萄）、蔬菜（如蘑菇）及发酵食品（如酱油）等食物中[8]，目前，Ery 已由FDA批准作为甜味剂使用[9]。研究显示，Ery 参与人体的代谢过程[4]，也可以通过调节固有免疫，降低代谢紊乱，改善高脂饮食引起的小肠炎症[5]。但目前为止，Ery 是否对ALI 有缓解作用尚未见报道。

当ALI 发生时，可导致肺组织的间质水肿、中性粒细胞的聚集及肺泡上皮损伤，破坏正常的生理结构，从而影响其生物学功能。本研究通过肺组织病理切片评估肺损伤的严重程度，通过湿/干比值评估肺水肿的情况，结果显示，Ery 可以有效缓解LPS 诱导的小鼠ALI 肺组织的损伤程度，显著抑制肺水肿程度。以上结果表明，在ALI 中，Ery 可以通过减轻肺组织水肿程度发挥保护作用。

研究表明，当出现炎症反应或创伤应激时，炎症通路被激活，炎症反应可以清除病原体，但过度的炎症反应会导致肺泡损伤，炎症介质是炎症的主要效应物，炎症因子将大量炎症细胞募集到受损组织中，大量中性粒细胞聚集，释放活性氧，造成肺间质和肺实质损伤，最终导致呼吸衰竭，甚至全身性炎症反应[10]。MPO 是中性粒细胞聚集的主要标志，可用于评估中性粒细胞在组织中的浸润程度，抑制MPO 活性可有效减轻炎症反应。本研究结果显示Ery 预处理后，MPO 活性显著降低，缓解了ALI 小鼠肺组织中性粒细胞的浸润程度。当炎症反应发生时，炎症信号通路被激活，IL-6 的表达增高[10]。本研究通过测定小鼠肺泡灌洗液中IL-6 的表达情况评估肺损伤炎症反应的严重程度，结果显示，Ery 显著抑制了IL-6 的表达，减轻了ALI 小鼠炎症反应的严重程度。因此，在LPS 诱导的ALI 小鼠模型中，Ery 可能通过抑制炎症反应发挥保护作用。

本研究进一步探讨了Ery 对ALI 的潜在机制。NF-κB 是经典的炎症信号通路，参与ALI 的形成，p65是该信号通路中的关键节点信号。在正常生理状态下p65 蛋白与IκB 蛋白处于集合状态；当炎症发生时，p65 蛋白转位进入细胞核并结合在促炎症基因表达的启动子上促进炎症因子释放，加剧炎症反应，进而参与ALI 的形成。有研究指出p65 蛋白的磷酸化加剧了ALI 的严重程度，而有效抑制p65 蛋白的磷酸化则缓解了炎症介质的释放进而从减轻炎症的角度缓解了ALI的发生、发展[11]。结合以上研究思路，本研究探究了Ery 是否可以通过抑制NF-κB-p65 蛋白的磷酸化，实验结果表明，LPS 刺激显著增加了p65 的磷酸化水平，Ery 可以逆转LPS 诱导的p65 的磷酸化，从而发挥抗炎作用。同时，为了解Ery 与NF-κB 作用的潜在对接位点，本研究应用AutoDock 工具及PyMOL 软件进行分子对接，结果发现，Ery 和p65 蛋白的结合能为-2.18 kcal/mol，并且Ery 与p65 蛋白的氨基酸残基ARG-246、GLN-247 具有氢键相互作用，上述结果表明Ery 与p65具有较强的结合作用，进一步验证了Ery 和p65 信号的抑制作用。说明Ery 抑制了NF-κB 相关信号通路，这揭示其可能与p65 蛋白存在相关作用，并抑制NF-κB信号通路。

综上所述，Ery 对LPS 诱导的小鼠ALI 具有保护作用，其潜在机制是Ery 通过抑制p65 信号的激活进而抑制炎症反应，从缓解炎症损伤和水肿的角度发挥了对ALI 的保护作用。Ery 可能成为治疗ALI 的潜在药物，但其在治疗过程中发挥作用的代谢产物及机制有待深入的研究。