PCBP3 过表达对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响

潘烽平 张明明 陈一鹏

据统计，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）发病率和致死率分别居第3 位和第2 位，是全球癌症相关死亡的主要原因之一[1]。预计2040 年全球将新增300 多万例新CRC 患者[2-4]。目前治疗CRC 的标准仍是手术切除，但约1/3 的患者术后存在远处转移和抗肿瘤药物耐药的问题[3]。因此，积极探索CRC 发生和发展机制是当前迫切需要解决的难题。研究表明，多聚胞嘧啶结合蛋白（polycytidine-binding protein，PCBP）可以特异性结合RNA 多聚胞嘧啶区域[4]。在哺乳动物细胞中，PCBP 可分为两类：第一类是核内不均一核糖核蛋白，包括核内不均一核糖核蛋白K/J；第二类为α-复合物蛋白，包括4 种亚型，即PCBP1～4[5]。PCBP 家族具有一个重要特征，其包含3 个hnRNP K 同源（KH）结构域，即约70 个氨基酸组成的RNA 结合模块。其中PCBP1、PCBP2 具有高度的氨基酸序列相似性（89%），而PCBP3、PCBP4 氨基酸序列的差异较大，其中PCBP4氨基酸序列的差异最大[6]。PCBP 家族可通过多聚胞嘧啶结合能力来发挥多种功能[7-9]，包括mRNA 稳定、翻译沉默和翻译增强等。PCBP4 可诱导细胞凋亡，其表达可通过延缓细胞周期进展进而抑制体内外肺癌细胞的增殖[7]。最重要的是，PCBP 家族可通过与基因启动子上的特定元件结合，在真核细胞中起到信号依赖性和协调性的转录调节作用。另有文献报道，μ 阿片受体启动子区可与PCBP3 结合，从而调控μ 阿片受体的转录[10-11]，这说明PCBP3 具有RNA 结合蛋白的功能。那么PCBP3 是否参与CRC 的发生、发展，目前尚无相关报道。因此，本研究就PCBP3 过表达对CRC 细胞增殖和迁移的影响作一探讨，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2022 年5 至6 月在嘉兴市第一医院行CRC 切除术患者的CRC 组织及癌旁正常组织标本各10 份。所有患者术前均未接受过放化疗且无远处转移。本研究经本院医学伦理委员会审查通过（批准文号：LS2021-KY-043），所有患者知情同意。

1.2 细胞培养与转染 人CRC 细胞系HCT116、HT29均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。（1）细胞培养：将HCT116、HT29 细胞置于含10% FBS 的RPMI 1640 培养基中，加入青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/mL，在37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养1～2 d，更换新鲜培养液；待细胞贴壁生长至70%～80%时，加入乙二胺四乙酸（0.02%）和胰蛋白酶（0.25%）消化传代，取对数生长期细胞用于后续实验。（2）构建含有PCBP3 CDS 区序列的过表达质粒（PCBP3-pcDNA3.1，上海吉凯基因），分别转染HCT116 和HT29 细胞（设为HCT116 过表达组、HT29 过表达组），放至培养箱中培养，均经qRTPCR、Western blot 法验证转染成功，继续进行后续实验；而未经转染的HCT116 和HT29 细胞分别设为HCT116 对照组、HT29 对照组。

1.3 mRNA 表达水平检测 采用qRT-PCR 法。分别取CRC 组织标本、癌旁正常组织标本，加入Trizol 试剂（批号：15596018，Thermo Fisher 公司）抽提总RNA。经定量分析后，按照反转录试剂盒说明书将1 mg RNA 反转录为cDNA；取1 μL cNDA 在ABI 7500 qRT-PCR 仪上进行PCR，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为 内 参 进 行 校正。所有实验重复3 次，取平均值。引物序列如下：GAPDH 正 义：5'-GCGGGGCTCTCCAGAACATC-3'，反义：5'-TCCACCACTGACACGTTGGC-3'；PCBP3 正 义：5'-AGCCAGTGTGGGTCCCTGAT-3'，反 义：5'-TGGGGACTCCAGCATGACCA-3'。采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA 表达水平。

1.4 蛋白表达水平检测 采用Western blot法。分别取CRC 组织标本、癌旁正常组织标本、HCT116 细胞、HT29细胞，加入RIPA 裂解液（批号：WB0101，上海威奥生物科技有限公司），采用BCA 法测定蛋白浓度。加入10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜。使用5%脱脂牛奶在室温下孵育2 h，再加入对应的一抗PCBP3 抗体（批号：ab154252，英国Abcam 公司）1∶500、E-钙黏蛋白（E-cadherin）（批号：ab231303，英国Abcam公司）1∶500、裂解的胱天蛋白酶3（cleaved cysteine aspartic acid specific protease-3，Cleaved Caspase-3）（批号：#9661，美 国CST 公 司）1∶500、GAPDH（批 号：ab8245，英国Abcam 公司）1∶1 000，4 ℃孵育过夜；加入适当的辣根过氧化物酶结合的抗兔或抗小鼠二抗（批号：ab6728 或ab6721，英国Abcam 公司）1∶20 000 孵育1 h 后，检测结合的一级抗体。使用Thermo Scientific增强化学发光仪检测蛋白条带灰度值，以目的蛋白灰度值与GAPDH 灰度值的比值作为目的蛋白相对表达水平。

1.5 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。取HCT116、HT29 细胞，按照4×107个/L 的密度分别接种至96 孔板，100 μL/孔。每隔24 h 分别加入CCK-8 试剂10 μL，于0、24、48、72 h 用酶标仪检测450 nm 处的吸光度（optical density，OD）值。

1.6 细胞侵袭能力检测 采用Transwell 实验。将HCT116、HT29 细胞分别稀释成1×109个/L 的细胞悬液；取100 μL 置于上室，300 μL 置于下室。待细胞培养72 h 后加入4%甲醛溶液固定10 min，吉姆萨染色，在Leica DMi8 S 显微镜下计数并拍照。通过计算两组细胞数量来估算细胞侵袭能力。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0 统计软件。计量资料组间比较采用两独立样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC 组织与癌旁正常组织中PCBP3 mRNA 及蛋白表达水平比较 CRC 组织和癌旁正常组织中均有PCBP3 表达，其中CRC 组织中PCBP3 mRNA 及蛋白表达水平均明显低于癌旁正常组织（均P＜0.05），见图1。

图1 CRC 组织与癌旁正常组织中PCBP3 mRNA 及蛋白表达水平比较（A：mRNA 表达水平比较，a P＜0.05；B：PCBP3 蛋白表达的电泳图；C：蛋白表达水平比较，a P＜0.05）

2.2 PCBP3 过表达对CRC 细胞增殖能力的影响 与对照组比较，PCBP3 过表达可明显减弱HCT116 和HT29 细胞增殖能力（均P＜0.05），见图2。

图2 PCBP3 过表达对CRC 细胞增殖能力的影响（A：HCT116细胞，与HCT116 对照组比较，aP＜0.05；B：HT29 细胞，与HT29对照组比较，aP＜0.05）

2.3 PCBP3 过表达对CRC 细胞侵袭能力的影响 与对照组比较，PCBP3 过表达可明显减弱HCT116 和HT29 细胞侵袭能力（均P＜0.05），见图3。

图3 PCBP3 过表达对CRC 细胞侵袭能力的影响（A：HCT116 细胞，吉姆萨染色，×20，aP＜0.05；B：HT29 细胞，吉姆萨染色，×40，aP＜0.05）

2.4 PCBP3 过表达对CRC 细胞E-cadherin、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平的影响 与对照组比较，PCBP3过表达可明显上调HCT116 和HT29 细胞E-cadherin、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平（均P＜0.05），见图4-5。

图4 PCBP3 过表达对HCT116 细胞E-cadherin、Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平的影响（A：电泳图；B：E-cadherin 蛋白表达水平比较，aP＜0.05；C：Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平比较，aP＜0.05）

图5 PCBP3 过表达对HT29 细胞E-cadherin、Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平的影响（A：电泳图；B：E-cadherin 蛋白表达水平比较，aP＜0.05；C：Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平比较，aP＜0.05）

3 讨论

CRC 是全球第三大癌症死亡原因，其发病率在发展中国家逐年上升[12]。随着社会人口老龄化加剧，CRC 发病率和病死率可能继续升高[13-14]。因此，深入探讨CRC 的发生、转移机制具有一定的临床意义。

PCBP 家族在人和小鼠胃肠道组织中广泛表达，其中PCBP1、PCBP2 能调控肿瘤的发生[7]。但PCBP3 在CRC 发生、发展中的生物学功能和调节机制，目前尚无文献报道。因此，本研究作了初步探讨，结果发现PCBP3 在人癌旁正常组织中呈高表达，但在CRC 组织中表达水平明显降低，笔者推测其在肿瘤发生、发展中的作用可能与PCBP4 相似[15]。进一步开展细胞学实验，结果发现过表达PCBP3 能明显减弱CRC 细胞增殖和侵袭能力，同时明显上调肿瘤转移抑制蛋白分子E

cadherin 和凋亡分子Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平。以上结果验证了PCBP3 在CRC 细胞増殖、侵袭过程中表现出的生物学特征，同时揭示其对CRC 发生、发展的影响。

综上所述，PCBP3 过表达能抑制CRC 细胞增殖和侵袭，可能通过上调E-cadherin、Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平发挥作用。