天山北麓4个山葡萄品种枝条抗寒性综合评价

潘越，刘珩，王明，韩政伟,2，郭靖,2，张浩,2，王季姣,4，马勇,4，杜林峰

（1. 新疆林业科学院，新疆乌鲁木齐 830063；2. 新疆林业科学院佳木国家重点林木良种基地，新疆温宿 843100；3. 新疆阿克苏森林生态系统国家定位观测研究站，新疆温宿 843100；4. 新疆农业大学林学与风景园林学院，新疆乌鲁木齐 830052；5. 昌吉州林业技术推广中心，新疆昌吉 831100）

山葡萄是葡萄属中最抗寒的一个种[1]，新疆独特的区位地理及环境因素，使山葡萄具备很大发展潜力。自2019年以来，新疆林科院陆续从吉林地区引进抗寒性状表现优异的10余个山葡萄品种， 经驯化、区域栽培试验，从中筛选出4个适应性良好的品种，目前栽培面积稳中有升，产量持续增加。沿天山北麓地带光照充裕，空气干燥，昼夜温差大，有利于糖分累积，但受春季回温加速和冷暖交织加剧影响，葡萄出土后极易遭受霜冻灾害[2-3]，影响酿酒葡萄产业的健康发展，为此筛选出高抗寒的品种对该区域的酿酒葡萄产业发展具有重大意义。

低温胁迫是一种限制植被生长与分布的非生物胁迫因素。关于植物抗寒性的研究多集中在通过测定相对电导率和Logistic方程推算半致死温度的方法，对葡萄抗寒性的研究也有很多，如贾金辉等[4]以8个酿酒葡萄为试材，通过测量一年生枝条相对电导率，基于隶属函数值和半致死温度综合排序，得出‘双丰’抗寒性最强；刘钰玺等[5]基于主成分分析对葡萄抗寒性综合评价时认为，评价结果与半致死温度LT50存在极显著相关性，通过计算半致死温度，可有效判别不同品种间的抗寒性。同时，通过探究渗透调节物质丙二醛[6]、游离脯氨酸[7]和保护酶系统[8]等与植被抗寒能力的差异性， 亦可间接反映植被的抗寒水平。目前，关于葡萄的抗寒性及品种的生物学特性研究很多，但是对天山北麓引进的山葡萄抗寒生理评价方面的研究报道较少。

为进一步探索山葡萄在天山北麓生态区域的抗寒生理特性，试验以‘北冰红’等4个适应性良好的品种为试材，对一年生休眠枝条的抗寒生理指标及萌芽率进行调查，综合评价各个品种的抗寒性，为天山北麓生态区域筛选自然越冬的高抗寒山葡萄品种提供理论依据。

1 材料与方法

供试的4个山葡萄品种（北冰红、双红、左优红、雪兰红）一年生苗于2019年秋从中国农科院特产所（左家）引进，窖内保存， 2020年3月于温室内炼苗，5月种植在新疆乌鲁木齐三坪农场山葡萄资源汇集圃。于2021年12月中旬，每个品种随机选取5株树，采集充分成熟、无病虫害、长势一致的一年生枝条。所有枝条的朝向及位置尽量保持一致，使用凡士林涂抹剪口，根据品种分别装入聚乙烯保存袋中，于0～4 ℃冰箱内保存。

1.1 试验处理

采回的一年生枝条分段，剪成10 cm的长度，自来水冲洗干净，再用离子水冲刷3次，吸干枝条表面水分，每个品种分为5份，纱布包裹后置入超低温冰箱进行低温处理。共设置0、-10、-20、-30、-40 ℃ 5个梯度，冷冻降温幅度及解冻升温幅度均保持5 ℃·h-1，到达预设温度时维持12 h后解冻，测量相关生理指标，每组处理3次重复。

1.2 试验方法

1.2.1 生理指标的测定

相对电导率的测定。将低温处理后的枝条剪成2～3 cm的小段，避开芽眼，称取1 g置入三角瓶内，加入20 mL重蒸馏水，放置摇床室温环境浸提10 h，用电导仪（型号：DDS-11A）测定此时电导率（R）。用保鲜膜将三角瓶瓶口封好置入沸水浴中蒸煮30 min后浸提10 h，测量此时电导率R0。每个样品设置3次重复，计算公式如下：

游离脯氨酸（Pro）采用酸性茚三酮法测定[9]；丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法测定[10]，在450、532、600 nm分别测量吸光度值，计算含量；可溶性糖采用蒽酮乙酸乙酯法测定[11]；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）还原法测定[11]。

1.2.2 萌芽率的测定

枝条经不同低温梯度处理12 h后扦插于温室（25～28 ℃）营养钵内，每个营养钵扦插6根枝条，以体积比2∶1的草炭土和锯末作为基质，每组处理重复3次，1个月后统计枝条芽体萌发情况，以破磷露白为标志，萌芽率（%）=萌发芽眼数/扦插枝条芽眼总数×100。

1.3 数据分析

1.3.1 半致死温度的计算[12]

各品种半致死温度LT50拟合曲线方程为：

其中，Y为相对电导率，a、b是方程参数，K是常数，此处取值100。LT50为方程拐点，计算公式如下：

1.3.2 主成分分析

主成分分析是将多项复杂指标简化为少数综合指标的统计学方法，在保证原始信息损失少且减少变量数目的前提下，采用少数变量反映原始信息[13-15]。

在对山葡萄枝条抗寒能力进行综合评价之前，考虑到各指标数量纲不一致，其中MDA为达到峰值时的温度，其值越低越好，萌芽率、SOD、游离Pro、可溶性糖和半致死温度均为值越高越好，为此在进行主成分分析前，基于隶属函数法对原始数据进行标准化处理。

设X=(X1，X2，…Xn)'，设n为随机向量，其线性关系式如下：

将PC1代替原来p个变量X1，X2，…，Xp，PC1会尽可能多的反映原始变量的信息，如若PC1不足以反映原始的绝大多数信息，则考虑引入PC2，据此类推。主成分分析成分个数m需依据各个成分的累计方差贡献率最终确定。

式中，λ为各成分所对应的特征值；k为选定的成分数；i为全部成分数。

主成分分析，通过主成分载荷矩阵Ai和特征向量λ计算各成分系数矩阵Ti，计算公式如下：

其中，A为不同山葡萄品种的成分值，C为各成分的贡献率（i=1，2，…）。主成分分析采用SPSS 21.0进行。

2 结果与分析

2.1 不同低温处理下山葡萄相对电导率的变化

由图1可见，经不同梯度低温处理后，4个山葡萄品种的相对电导率与处理温度呈“S”型上升趋势，各品种的相对电导率在0～-20 ℃缓慢上升，其中‘左优红’上升幅度最小，‘双红’次之，‘北冰红’上升幅度最大；在-20～-30 ℃表现为急速上升状态，在-30 ℃时，‘双红’相对电导率显著低于其他品种；在-30～-40 ℃，各品种上升幅度趋于平缓。4个山葡萄品种在相同低温处理下的相对电导率差异较大，伴随温度降低，相对电导率上升幅度不一，增幅在56.95%～65.94%，这主要与品种间抗寒能力的差异有关。

图1 不同低温处理后4个山葡萄品种枝条相对电导率的变化Figure 1 Changes in relative conductivity of four Vitis amurensis Rupr. branches with different temperatures treatments

2.2 半致死温度的比较

根据相对电导率，基于Logistic方程拟合得出不同山葡萄品种的半致死温度。不同低温梯度处理下材料的Logistic方程、拟合度及半致死温度见表1。4个山葡萄品种的半致死温度在-29.193～-20.236 ℃，拟合度均大于0.900，达到极显著水平。由于半致死温度与植物抗寒能力呈负相关，抗寒性越强，半致死温度越低[16]。由此得出抗寒性由高到低排序依次是：双红＞北冰红＞左优红＞雪兰红。

表1 山葡萄枝条Logistic方程及半致死温度Table 1 The relative conductivity Logistic equation parameter and semilethal temperature (LT50) of Vitis amurensis Rupr. shoots

2.3 低温胁迫下各品种枝条抗寒生理指标变化

表2可以看出，从0～-30 ℃，MDA、游离Pro、可溶性糖含量和SOD活性均随着温度的降低而增加，枝条萌芽率则与之相反。‘左优红’在-20、-30、-40 ℃时， MDA含量显著高于其他3个品种；‘北冰红’‘左优红’‘双红’和‘雪兰红’游离Pro的最大值分别是55.46、45.38、53.23、49.47 μg·g-1。多重比较可知，‘北冰红’与‘双红’差异不显著，但均显著高于‘左优红’；4个品种的SOD活性均在-30 ℃达到最高，由高到低排序依次是北冰红＞双红＞左优红＞雪兰红；4个品种可溶性糖含量均伴随胁迫温度的降低而增加，均在-40 ℃达到最大值；枝条萌芽率方面， ‘北冰红’和‘双红’在-10～-30 ℃区间内萌芽率下降幅度较小，‘左优红’和‘雪兰红’下降幅度较大，‘左优红’和‘雪兰红’在-30 ℃时的萌芽率显著低于-10 ℃和-20 ℃，4个品种均在-40 ℃时萌芽率最低。

表2 低温条件对山葡萄枝条抗寒生理指标及萌芽率的影响Table 2 Changes of MDA content、Pro content、 SOD activity 、Soluble sugar and Germination rate in branches from different Vitis amurensis Rupr. under low temperature stress

2.4 山葡萄枝条各项生理指标的主成分分析

从表3中看出，前两个主成分的特征根＞1，且累计解释方差达95.072%，包含了原始数据的绝大部分信息，为此提取前两个主成分进行分析。

表3 主成分特征值Table 3 Component eigenvalue

为突出主要因子对评价结果的影响，对公因子进行最大正交旋转，得到的旋转载荷矩阵见表4。主成分f1载荷值较高的抗寒指标包括萌芽率、半致死温度、脯氨酸和SOD，载荷权数依次为：0.940、0.892、0.868和0.951，这4项指标对第1主成分产生正向影响。

表4 旋转后的主成分载荷矩阵Table 4 Rotated principal component loading matrix

第2主成分载荷值较高且符号为正的指标包括：丙二醛和可溶性糖，载荷权数依次是0.746和0.994，这2项指标对第2主成分产生正向影响。

用各指标的主成分载荷除以与主成分对应的特征根，开算数平方根，得出2个主成分每项指标对应的系数（即为特征向量），将特征向量与测得的数据结果相乘，即可得出2个主成分的函数表达式（ZX为标准化后的结果）：

上述表达式中，X1为萌芽率、X2为半致死温度、X3为丙二醛、X4为脯氨酸、X5为SOD、X6为可溶性糖。

以各主成分的特征值占特征值总和的比例作为权重，得出综合评价函数fz=A1f1＋A2f2，其中A1=λ1/(λ1＋λ2)，A2=λ2/(λ1＋λ2)。λ1和λ2分别为2个主成分的特征值。表5所示，综合得分由高到低排序依次为：双红＞北冰红＞雪兰红＞左优红。

表5 不同山葡萄品种主成分得分、综合得分及排序Table 5 Scores of each principal component, composite scores and sequence of different Vitis amurensis Rupr. varieties

3 讨论与结论

植被抗寒机理较为复杂，评价一个品种的抗寒能力无法单独通过某一个指标来确定，而应通过多项指标进行全面综合评判[17]。Lyons等[18]发现，植被遭受冻害时，受害程度较低或抗寒性较强的品种不但电导率增加幅度较小，且细胞渗透性变化可以逆转；受害程度较重或抗寒性较差的品种则反之。本研究发现，伴随处理温度的降低，不同山葡萄品种的电导率逐渐升高，通过Logistic曲线方程模拟了4个山葡萄品种的LT50范围在-29.193～-20.236 ℃，天山北麓生态区域冬季平均气温-10.6 ℃，平均最低气温-24.6 ℃，按照本试验判断‘北冰红’和‘双红’均可自然越冬。然而生产上天山北麓生态区域山葡萄自然越冬下，仍表现出干枯、抽梢冻害等现象，推测引起酿酒葡萄产生冻害的原因不仅与当年低温有关，还与当年降雪覆盖量、控水控肥和开春时干热风发生频率有关。因此为防止冻害发生，生产上宜通过铺设地膜提高地温等抗寒辅助措施进行预防。

MDA是植物在受到低温冻害时产生的过氧化产物，会对细胞产生一定的毒害作用[19-20]。游离Pro可以调节细胞的渗透压，防止细胞过度脱水进而增强植被抗寒性[6,21]。本研究发现，‘双红’的MDA含量较小，抗寒性较强，‘北冰红’和‘双红’游离Pro含量较高，适应低温环境的能力优于其他两个品种。可溶性糖作为蛋白质和细胞膜的重要保护剂，其积累量越高越能帮助植被免于冻害[22-23]。本研究中的4个山葡萄品种随着温度降低，对外界环境做出应激反应，从而使可溶性糖含量持续增加，出现这种情况主要是由于低温胁迫之初，山葡萄对外界不良环境做出的应激反应，使可溶性糖含量增加；当温度过低造成细胞死亡，可溶性糖含量下降。

植被活性氧清除系统包括酶促及非酶促抗氧化系统，酶促系统包含过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、脱氢抗坏血酸还原酶和谷胱甘肽还原酶等[5,24]，非酶促抗氧化系统主要由还原性谷胱甘肽和抗坏血酸构成。本研究发现，‘北冰红’和‘双红’的SOD表现优于‘雪兰红’和‘左优红’。杨盛[25]等研究发现，低温胁迫下，植物体酶活高于正常水平。本研究供试的4个山葡萄品种酶活性变化幅度明显不同，抗寒性强的品种在受低温胁迫后酶活性增加幅度大，抗寒性弱的品种反之，且随着低温加剧，在到达-40 ℃后酶活性迅速降低，由此证明在轻度低温胁迫环境下，山葡萄可通过增加酶活性减轻胁迫伤害，在胁迫程度超过保护酶系统清除能力时，氧化酶活性开始下降。

为了更全面地对植被的抗寒性进行评价，避免单一指标鉴定的不足，科研工作者先后提出了隶属函数法[26]、直接比较法[27]和分级比较法[5]等。刘钰玺等[5]对不同葡萄砧木抗寒性进行了主成分分析和聚类分析，所得结果与田间观察基本一致。本研究基于主成分分析法得出， 4个山葡萄品种的抗寒性由高到低依次为：双红＞北冰红＞雪兰红＞左优红，与Logistic曲线方程模拟半致死温度结果大致吻合。