响应面法优化‘赤霞珠’葡萄皮可溶性膳食纤维的提取工艺

范雪梅，万龙楠，段雪荣，侍朋宝*

（1. 贵州茅台酒厂(集团)昌黎葡萄酒业有限公司，河北昌黎 066600；2. 河北科技师范学院食品科技学院，河北昌黎 066600）

中国营养学会将膳食纤维（Dietary fiber，DF）定义为植物中天然存在的、从植物中提取或直接合成的聚合度≥3、可食用的、不能被人体小肠消化吸收的、对人体有健康意义的碳水化合物的聚合物[1]。从其定义可以看出，膳食纤维是一大类物质的总称，主要来源有三大类：（1）天然存在于植物如水果、坚果、蔬菜、全谷物等的基本组成部分；（2）由食物原料经物理、化学或酶法等提取获得的碳水化合物的聚合物；（3）合成的碳水化合物的聚合物[1]。随着居民膳食结构的改变，动物性食物消费量增加，谷类消费减少和加工精度不断提高，影响了膳食纤维的摄入，仅有约20%的人群达到推荐的适宜摄入量，即每天25 g，有约50%的人群膳食纤维的摄入量占适宜摄入量的40%～79%[2]。因此，有必要从食物原料中提取膳食纤维，作为食品添加剂、营养强化剂或食品原料等，以补充人们日常膳食纤维的摄入。

自然界大约有千种以上的膳食纤维，包括纤维素、半纤维素、果胶、瓜尔胶、黄原胶、抗性低聚糖、抗性淀粉、木质素类等[3]。根据溶解性，可将膳食纤维分为不溶性膳食纤维（Insoluble Dietary Fiber，IDF）和可溶性膳食纤维（Soluble Dietary Fiber，SDF）[4]。IDF主要作用于肠道产生机械蠕动效果，促进胃肠健康，对便秘和肥胖症等有较好的治疗效果；SDF除具有一般纤维的生理作用外，与IDF比较，在抑制血清胆固醇、高血脂、高血糖和高血压方面具有更强的作用[5]。因此，适当增加DF中SDF的比例可更好的发挥其生理功能。有学者提出SDF与IDF的比例为1∶3时，DF组成合理，能够最佳地发挥DF的生理功能[6]，但许多天然存在的DF资源中的SDF所占比例偏低，因此采用不同的方法如化学法[7]、物理法[8]、酶法[9-12]等提取，以提高SDF的含量，受到了人们的重视。

2021年，全球葡萄园面积730万公顷，我国葡萄种植面积78.26万公顷，仅次于西班牙和法国，居世界第3位；鲜食葡萄产量1120万吨，占世界产量的16.1%，居世界第1位[13]。2022年，全国规上葡萄酒生产企业完成酿酒总产量21.37万千升[14]，葡萄皮渣等副产物可达4.5万吨。葡萄皮渣中总膳食纤维含量较高，可达皮渣干质量的75%[15]。不同葡萄品种皮渣SDF含量占葡萄皮渣干质量的比例有较大的差异，不同提取方法所得结果也不同[10]。酶法提取具有工艺简单、反应条件温和、所得产品纯度高等优点，因此采用酶法提取的研究较多，但不同研究SDF的提取率存在较大差异，为14.32%～34.04%不等[9,11,16-18]，可以看出酶法提取葡萄皮渣SDF所得结果并不稳定，可能与试验具体条件、所用葡萄品种不同等因素有关。

河北昌黎是我国主要酿酒葡萄产区之一，栽培品种以‘赤霞珠’为主，每年均有可观数量的葡萄皮渣产生，利用葡萄皮渣提取膳食纤维，对资源综合利用，提高土地附加值，促进葡萄与葡萄酒产业的可持续发展具有重要意义。本研究通过单因素和响应面优化酶法提取试验方法，以SDF得率为指标，探讨从‘赤霞珠’葡萄皮中提取SDF的最佳工艺参数，为葡萄废弃物综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

‘赤霞珠’葡萄果皮：葡萄酒发酵结束后，压榨分离皮渣，并去除种子，由贵州茅台酒厂（集团）昌黎葡萄酒业有限公司提供。

1.2 试剂

无水乙醚：天津市汇杭化工科技有限公司；NaOH：天津市大茂化学试剂厂；柠檬酸：上海安谱实验科技股份有限公司；乙醇、磷酸氢二钠：国药集团化学试剂有限公司。以上均为分析纯。

纤维素酶（1,4-β-D-葡聚糖葡糖苷水解酶，CAS号：9012-54-8），50 U·mg-1，上海源叶生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

HH-4数显恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；JA3003型电子天平：上海良平仪器仪表有限公司；PHS-3C型酸度计：上海精密科学仪器有限公司；抽滤机：天津市腾达过滤器件厂；BGZ-76型鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司；TGL-16型离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.4 方法

1.4.1 可溶性膳食纤维的提取

将葡萄皮用鼓风干燥箱于80 ℃烘干后粉碎，过60目筛，取一定量粉末用无水乙醚反复浸泡脱脂，至没有油脂析出，用80%（Vol，下同）的乙醇洗涤除去乙醚后烘干。按1∶10（g·mL-1）的料液比加入0.5%NaOH溶液，于50 ℃水浴中搅拌处理2 h。用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调pH值，加入纤维素酶，酶解一定时间后，升温至100 ℃，灭酶10 min；降温后，于8000 r·min-1离心20 min；取上清液加热蒸发至原体积的1/3，加入4倍体积的无水乙醇，静置60 min，之后于8000 r·min-1离心20 min，沉淀于80 ℃烘干即为可溶性膳食纤维[9-12]。

1.4.2 单因素试验

（1）酶用量对葡萄皮渣中SDF提取率的影响

①将1 g葡萄皮粉末与蒸馏水按1∶10料液比混合，加入0.5% NaOH溶液，于50 ℃水浴中搅拌处理2 h，用缓冲溶液调pH值为5，添加纤维素酶500 U·g-1，在50 ℃条件下酶解4 h。②酶解反应结束后，水浴温度100 ℃，灭酶10 min。③降温后离心，取上清液加热蒸发并加入无水乙醇静置，之后于8000 r·min-1离心20 min，沉淀于80 ℃烘干即为SDF。④依次将酶用量改为0、1000、1500、2000 U·g-1，重复①～③的操作。

（2）酶作用时间对葡萄皮渣中SDF提取率的影响

依次将酶解时间改为1、2、3、5 h，添加纤维素酶量为上述试验所得最佳酶量，重复1.4.2(1)的试验。

（3）pH对葡萄皮渣中SDF提取率的影响

依次将pH改为3.5、4、4.5、5.5，添加纤维素酶量为上述所得最佳酶量，作用时间为以上所确定的最佳时间，重复1.4.2(1)的试验。

（4）酶作用温度对皮渣中SDF提取率的影响

将温度依次改为40、45、55、60 ℃，调pH值为上述实验所确定的最佳pH值，添加纤维素酶量为上述最佳酶量，时间为以上所确定的最佳时间，重复1.4.2(1)的试验。

1.4.3 优化试验

根据单因素试验结果，以加酶量、酶作用时间、pH、酶作用温度为响应因子，采用 Design-Expert 8软件，设计Box-Behnken四因素三水平试验自变量，以SDF得率为响应值，通过响应面分析法优化提取工艺参数。

1.4.4 可溶性膳食纤维提取率的计算

采用酶-重量法测量皮渣中SDF的重量[7,19]，即原料经预处理后在一定温度、时间、加酶量、pH值条件下经纤维素酶作用后，测定料液中的SDF含量。结果以SDF的提取率为指标。

SDF提取率（%）=(提取的SDF质量/原料质量)×100

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶用量对SDF提取率的影响

不同纤维素酶添加量对SDF提取率的影响结果见图1。加入一定量的纤维素酶可以增加SDF得率，但当纤维素酶的添加量＞500 U·g-1后，SDF得率开始降低。由此确定纤维素酶最佳加入量为500 U·g-1。

图1 不同纤维素酶用量对SDF提取率的影响Figure 1 Effect of enzyme concentration on SDF extraction rate

2.1.2 酶作用时间对SDF提取率的影响

不同纤维素酶作用时间对SDF提取率的影响结果见图2。在1～4 h范围内随着作用时间的增加，料液中SDF提取率呈增加趋势。4 h后SDF的提取率开始下降，因此，反应时间取4 h。

图2 不同酶解时间对SDF率提取的影响Figure 2 Effect of time on SDF extraction rate

2.1.3 pH值对SDF提取率的影响

图3显示，当pH值由3.5增加至4.5时，对SDF提取率的影响很小。当pH值由4.5增至5.0时，SDF提取率明显增加，当pH值继续增大时，又呈下降趋势。由此可知，本试验条件下纤维素酶在pH值为5.0时酶促反应效率较高，因此确定5.0为最适pH值。

图3 不同pH值对SDF提取率的影响Figure 3 Effect of pH value on SDF extraction rate

2.1.4 酶作用温度对提取率的影响

不同纤维素酶作用温度对SDF提取率的影响结果见图4。40～45 ℃时SDF提取率升高至最高值，温度继续升高，SDF提取率逐渐下降，因此，确定最佳反应温度为45 ℃。

图4 不同温度对SDF提取率的影响Figure 4 Effect of temperature value on SDF extraction rate

2.2 响应面法优化酶解可溶性膳食纤维的结果分析

2.2.1 响应面因素水平和设计方案

通过单因素试验得出酶法提取SDF的最佳工艺参数：pH 5.0、加酶量500 U·g-1、酶解温度45 ℃、酶解时间4 h。在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken中心组合试验设计进行响应面试验，以影响SDF得率的主要参数pH（A）、加酶量（B）、酶解温度（C）、酶解时间（D）四因素为自变量，每个因素设三个水平，以SDF得率为响应值，试验因素水平及编码见表1。响应面试验设计（由Design-Expert 8软件根据四因素三水平试验设计自动生成的29种组合）及结果见表2。

表1 响应面试验因素和水平Table l Factors and levels of response surface test

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and result of response surface test

2.2.2 响应面回归模型的建立与分析

对表2的试验结果采用Design Expert 8软件进行分析，采用二阶模型，描述各因素与SDF提取率Y之间关系的多元二次模型：

模型的方差分析结果见表3。该模型F 值为19.31，P＜0.0001，达极显著水平；失拟项P=0.2045未达显著水平，相关系数R2为0.9508，说明响应值的变化95.08%来源于自变量，即模型对试验的拟合情况较好。pH、酶解时间及二次项A2、B2、C2对提取率的影响达极显著水平（P＜0.01）；酶解温度对提取率影响达极显著水平（P＜0.01）；交互项AB、AC、AD对提取率的影响达显著水平（P＜0.05）。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

2.2.3 响应面分析

试验中两因素的交互作用对提取率的影响可通过响应曲面来反映，响应曲面的曲率越大则交互作用越显著。本试验各因素交互作用对葡萄皮SDF提取率影响的响应面及等高线图见图5。当温度和提取时间一定时，随着pH的增加，提取率先增加后降低；随加酶量的增加，提取率先增加后降低，两因素之间的交互作用对提取率的影响显著。当加酶量和提取时间一定时，随着pH的增加，提取率先增加后降低；随反应温度的增加，提取率先增加后降低，两因素之间的交互作用对提取率的影响显著。当加酶量和温度一定时，随着pH的增加，提取率先增加后降低；随反应时间的延长，提取率呈增加趋势，两因素之间的交互作用对提取率的影响显著，以上结果均与表3中数据相吻合。

图5 各两因素交互作用的响应面及等高线图Figure 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of four process parameters on extraction yield of SDF

图5 各两因素交互作用的响应面及等高线图（续）Figure 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of four process parameters on extraction yield of SDF

2.2.4 提取工艺参数优化及验证

经软件优化得出葡萄皮SDF最佳提取工艺参数为：pH（A）5.19、加酶量（B）506.52 U·g-1、温度（C）44.32 ℃、时间（D）5.00 h，在此最佳工艺条件下SDF理论得率为31.6557%。考虑到实际操作的便利，将纤维素酶提取葡萄皮SDF的最佳条件修正为：pH（A）5.20、酶添加量（B）507.00 U·g-1、活化温度（C）44.50 ℃、活化时间（D）5.00 h。为了验证模型方程的可行性，在此条件下进行3组平行实验，实际测得的SDF平均提取率为31.20%，与理论预测值相差不大。表明数学模型对优化葡萄皮SDF的提取工艺参数可行。

3 讨论

本试验采用酶法提取葡萄皮中可溶性膳食纤维，试验所用纤维素酶能降解不溶性膳食纤维，使其分子间的氢键断裂，破坏分子间的结构而转化为可溶性膳食纤维。影响酶作用效果的因素有很多，主要的有反应温度、pH、酶浓度、底物浓度、抑制剂、激活剂等。本研究在前人研究结果[11,18]及前期试验基础上，考察了pH、加酶量、提取温度及提取时间等因素对可溶性膳食纤维提取率的影响。

pH主要通过影响酶分子构象稳定性、解离状态及底物分子解离或带电状态等影响酶的活性，过酸或过碱可导致酶变性失活，酶的解离状态或电荷状态与酶催化能力密切相关；底物的带电状态决定了其是否有利于与酶结合和被酶催化[20]。因此酶的催化反应对酸碱度非常敏感，本研究也得出pH对提取率的影响达到极显著水平，在试验考察的几个因素其影响最大，这与刘娅等[18]的研究结果一致。

酶用量对反应效果的影响与底物浓度有关，在酶促反应中，酶先要与底物形成中间复合物，当底物浓度大大超过酶浓度时，反应速率随酶浓度的增加而增加[20]。本试验中随着加酶量的增大，提取率达到一定值后呈降低趋势，这可能是由于适量的纤维素酶可以使一部分不溶性半纤维素变成可溶的半纤维素，以及一些不溶性膳食纤维转变成可溶性的葡聚糖，提高SDF含量。当酶的加入量超过一定值时，不溶性的膳食纤维进一步降解，生成分子量更低的小分子多糖、低聚糖或者单糖，无法被乙醇沉淀，使得SDF得率反而降低。

温度对酶作用的影响有两个方面，一是在一定温度范围内，随温度的增加反应速度增加，另一方面是温度超过酶的最适温度后，随着温度的增加，酶的变性程度加大，其催化活力降低，同时温度对酶的影响与反应时间也有关，因为温度促使酶的变性是随时间累加的[20]。本试验中SDF提取率随温度的增加呈现先升高后降低的趋势，说明试验所选温度包含该酶的适宜作用温度。

本研究中，随着反应时间的增加，SDF提取率呈现先增加后降低的趋势，这可能是由于开始时纤维素酶将IDF分解为SDF，使SDF随时间而增加，且随着反应时间的延长，纤维素酶进一步将SDF转变为寡糖和单糖，使得SDF得率下降，该变化趋势与郭红珍等[11]、刘娅等[18]的研究结果一致。

4 结论

在单因素试验基础上，采用响应面法优化‘赤霞珠’葡萄皮SDF提取工艺参数，响应面回归模型决定系数达极显著水平，与实际情况吻合较好，反映了各因素对SDF提取率的影响规律。优化出酶法最佳提取工艺参数为pH5.20、酶添加量507.00 U·g-1、活化温度44.50 ℃、活化时间5.00 h。在此条件下，‘赤霞珠’葡萄皮SDF提取率为31.20%。