番茄黑斑病病原菌的鉴定及生物学特性研究

乔镜澄+刘宇+马敬昊+王谦

摘要：从天津地区产的番茄黑斑病的疑似样本中分离得到5株形态相近的内生真菌，对其形态学和生物学特性进行研究。结果表明，该菌为链格孢菌[Alternaria alternate （Fr.） Kiessler]，PDA为其最适宜生长的培养基；菌丝在5～37 ℃ 范围内均能生长，最适的生长温度和孢子萌发温度为28 ℃，病原菌的致死温度为65 ℃处理20 min，菌丝生长和孢子萌发的最适pH值为6，黑暗条件最适合菌丝生长，分生孢子在黑暗条件下萌发率最高；该病原菌对碳源、氮源选择不苛刻，最适的碳源为乳糖，氮源为酵母膏。

关键词：番茄；黑斑病；病原鉴定；生物学特性；致死温度；最适生长

中图分类号： S436.412.1+9文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0094-03

番茄黑斑病是番茄常见的病害之一，此病是由半知菌亚门番茄链格孢真菌[Alternaria tomato （CKe.） Weber]侵染引起的，链格孢菌是茄科植物中危害较大的病害之一。该病不仅发生在田间，更是采后贮藏过程中的重要病害，可侵染番茄、茄子、辣椒、马铃薯等茄科类蔬菜，主要通过气孔、皮孔、伤口或表皮侵入果实，在适宜的条件下产生大量孢子，对果实造成严重危害[1]。

研究表明，链格孢菌所产生的选择性毒素对植物有致病性，对人体健康也有一定的影响[1]，所以研究链格孢菌的生长特性，探究链格孢菌在不同温度、pH值、光照、碳源和氮源下的菌落长势、直径、菌丝生长速率、菌丝干质量、产孢量的变化，可以探明链格孢菌在不同条件下的生长趋势。

1材料与方法

1.1试验材料

PDA固体培养基：200 g马铃薯，20 g琼脂，20 g葡萄糖，加水补足1 000 mL。PCA固体培养基：5 g胰蛋白胨，2.5 g酵母浸粉，1.0 g葡萄糖，20 g琼脂，pH值为7，加水补足 1 000 mL。胡萝卜固体培养基：将胡萝卜去皮后称取200 g，20 g琼脂，加水补足1 000 mL。番茄果肉固体培养基：200 g番茄，20 g琼脂，加水补足1 000 mL。V8果汁固体培养基：罐装V8果汁200 mL，20 g琼脂，加水补足1 000 mL。查彼（Czapek）固体培养基：2 g NaNO3，1 g K2HPO4，0.5 g KCl，0.5 g MgSO4，0.01 g FeSO4，30 g蔗糖，20 g琼脂，加水补足 1 000 mL。

1.2试验方法

1.2.1病原菌的分离

根据方仲达的方法[2]，对番茄发病处病原菌进行分离，采用单孢子分离法获得纯化菌株，在PDA培养基上培养后保存备用。生物学特性研究以所获得的纯化菌株tomato（b）为供试菌株。

1.2.2病原菌形态学鉴定

将供试菌株在PDA培养基上活化，25 ℃恒温培养6 d后，用无菌水制成一定浓度的孢子悬液，同时观察菌落颜色、大小、形状及分生孢子的形态和颜色，从而进行病原菌的鉴定。

1.3生物学特性的研究

1.3.1温度对菌丝生长和孢子萌发的影响[3]

用打孔器将菌体转移至PDA培养基上，分别置于1、4、15、25、28、30、37、40 ℃的培养箱内，黑暗条件下培养7 d，用十字交叉法测量菌落的直径，采用小室培养法，将孢子悬液滴于凹玻片上，置于以上条件下培养3、6、12 h后，分别检查孢子萌发率。使用棉蓝乳酚油固定孢子悬液，镜检200个孢子，记下萌发的孢子数量，计算萌发率。每个处理3次重复。

1.3.2pH值对菌丝生长和孢子萌发的影响

用1 mol/L的HCl和NaOH调节PDA培养基的pH值和孢子悬液的pH值为3～12。分别置于28 ℃恒温、黑暗条件下和小室恒温培养，观察菌落直径，计算孢子萌发率。

1.3.3光照条件对菌丝生长和孢子萌发的影响

将接入菌块的PDA培养基和孢子悬浮液，分别在光—暗周期为12 h—12 h、完全光照和完全黑暗3种处理条件下，于28 ℃恒温培养。观察菌落直径，计算孢子萌发率。

1.3.4不同培养基对菌株生长的影响

分别以PDA、PCA、番茄果肉固体培养基、V8果汁固体培养基和胡萝卜固体培养基用打孔器将菌体转移至固体培养基中心位置，置于28 ℃下恒温培养7 d，用十字交叉法测量菌落的直径。每个样品3次重复，计算平均值。

1.3.5不同碳源和氮源对菌丝生长和孢子萌发的影响[4]

选取D-木糖、D-果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖等量替换查彼培养基中的碳源（蔗糖），使得各个不同碳源培养基中碳的含量相同；用不加碳源的培养基作为对照。

选取L-谷氨酸、天冬酰胺、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等量替換查彼培养基中的氮源（硝酸钠），使得各个不同碳源培养基中氮的含量相同；用不加氮源的培养基作为对照。

将菌块转接到PDA固体平板中央，放置在28 ℃恒温培养箱内培养，3、6 d后用十字交叉法测量菌落的直径，对照平行组计算出平均数，每组试验重复3次。

1.3.6光照对菌株生长和孢子萌发的影响

将菌块转接到PDA固体培养基内，分别在光—暗周期为12 h—12 h、完全光照（全光）和完全黑暗（无光）3种处理条件下，28 ℃恒温培养箱内培养；3、6 d 后测量菌落的直径，对照平行组计算出平均数，每组试验重复3次。

将制备好的孢子悬浮液滴于凹玻片上，分别在光—暗周期为12 h—12 h、完全光照和完全黑暗3种处理条件下，28 ℃的恒温培养箱内培养，6、12 h后测定孢子萌发率。

1.3.7致死温度的确定

吸取1 mL孢子悬液至无菌试管中，分别置于40～65 ℃（以5 ℃为梯度）的恒温水浴锅中处理5～20 min后迅速冷却。将处理后的孢子悬液滴于凹玻片上，28 ℃小室培养，12 h后观察孢子萌发情况，测定孢子萌发率。

2结果与分析

2.1分离菌株的形态学观察

分离纯化后获得5株菌株，分别编号为tomato（a）、tomato（b）、tomato（c）、tomato（d）、tomato（e），将这些菌株培养 8 d 即可长满整个培养皿，该菌的基本形态特征为：在PDA培养基上，菌落较为致密，呈絮状平铺生长，菌落最外层为灰白色，边缘整齐，向内为墨绿色，有较清晰的轮纹；分生孢子梗分隔，有横纵隔膜，其中横膈膜1～5个，纵隔膜0～3个，呈棕黄色，常多个呈链状分布；单孢子短卵、椭圆或倒棍棒形（图1）。根据该菌株的培养形状及形态学特征，根据相关资料[5-10]，依据《真菌鉴定手册》的相关描述[11]，初步鉴定为链格孢菌[Alternaria alternate （Fr.） Kiessler]。

2.2生物学特性

2.2.1温度对菌株生长和孢子萌发的影响

由图2可知，在4、15、25、28、30、37 ℃中均可生长，其中28 ℃为最佳生长温度，培养3、6 d后菌落平均直径达到了30、50 mm，菌落生长速度快，菌丝浓厚茂密，颜色呈黑色，菌落边缘整齐。当温度小于15 ℃或大于37 ℃时，菌落生长明显受到抑制，菌丝变成灰白色，黑色孢子变少，菌落边缘分辨不清，菌株有老化迹象；培养6 d后菌落直径均小于30 mm。当温度为1、40 ℃时菌株不生长，也无萌发迹象。黑色链格孢分生孢子在4～37 ℃范围内均可萌发，其中4 ℃下培养6 h萌发率最低，为6.0%；28 ℃下培养12 h萌发率最高，为97.6%。当培养温度小于15 ℃或大于37 ℃时，分生孢子萌发率明显降低，培养12 h萌发率均低于35.0%；当温度小于4 ℃或大于37 ℃时，分生孢子则不能萌发。

2.2.2pH值对菌株生长和孢子萌发的影响[12]

由图3可以看出，番茄黑色链格孢菌在pH值为3～12的PDA固体平板培养基中均可生长，当pH值为6时，菌落生长速度最快；当pH值小于4或大于9时，菌株生长明显受到抑制。pH值为3～10时，培养12 h后平均有62.2%的病原菌孢子可以萌发；pH值为7时，病原菌孢子萌发率最高，培养12 h后萌发率为97.0%；当pH值大于11时，孢子不能萌发。综合考虑，菌丝生长和孢子萌发的最适pH值选为6。

2.2.3光照条件对菌株生长和孢子萌发的影响

2.2.5不同碳源和氮源对菌株生长和孢子萌发的影响

由图4可以看出，致病菌在D-木糖、D-果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖等7种不同碳源查彼固体平板培养基中均可正常生长，28 ℃培养3 d后，菌落平均直径在23.75～38.00 mm 之间；培养6 d后差异明显，菌落平均直径在 37.59～62.50 mm之间。在供试的7种不同碳源培养基中，D-木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖菌落平均生长直径优于其他培养基；其中，菌落生长状况最佳的为添加乳糖的查彼固体平板培养基，28 ℃中培养6 d后，菌落平均生长直径达到 62.50 mm，菌落生长速度快，菌丝浓厚茂密，颜色呈黑色，菌落边缘整齐；不加碳源的对照组则不生长。

试验结果（图5）表明，菌株在NaNO3、天冬酰胺、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-谷氨酸等6种不同氮源查彼固体平板培养基中均可正常生长，28 ℃培养3 d后，菌落平均直径在2500～43.00 mm之间；培养6 d后差异明显，菌落平均直径在 32.50～65.50 mm之间。在供试的6种不同碳源培养基中，NaNO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏菌落平均生长直径优于其他2种培养基；其中菌落生长状况最佳的为添加酵母膏的查彼固体平板培养基，28 ℃中培养6 d后，菌落平均生长直径达到65.50 mm，菌落生长速度快，菌丝浓厚茂密，颜色呈黑色，菌落边缘整齐；天冬酰胺则会抑制病原菌生长，28 ℃培养6 d后，菌落平均直径低于40.00 mm；不加氮源的对照组则没有生长。

2.2.6致死温度的确定

试验结果得出，供试菌株分生孢子在40～45 ℃处理5～20 min均可正常萌发；50 ℃处理20 min时萌发率明显降低，培养12 h后平均萌发率只有11%，且菌丝生长受到影响；65 ℃处理15 min后平均萌发率较50 ℃处理20 min后更低，培养12 h后平均萌发率只有3%；65 ℃处理[CM（25]20[KG*3]min后，病原菌分生孢子不能萌发，由此可知，实验室供[CM）]

试菌株的致死温度为65 ℃处理20 min，菌株有耐高温属性。

3讨论与结论

重点对番茄链格孢菌的生长特性进行研究，结果显示，此菌对PDA固体平板培养基中的营养物质利用率较高，生长速度较快。致死温度为65 ℃处理20 min；菌株生长和孢子萌发的最适温度为28 ℃；全黑暗培养下菌落生长速度最快，全黑暗下孢子萌发率最高。根据以上结论可知，此菌株生长特性与正常环境温度、光照条件相似，所以可以在很短的时间内侵染萌发、生长扩展，与其耐高温、不喜光、营养选择上的特性相同。

该菌株喜好偏酸至中性的生长条件，与果肉和果实本身的pH值相近，与报道已知的病原菌一样，菌株与寄主之间是相互作用的，这种特性有利于菌株本身的生长发育[13-15]，推论其自身代谢物也有可能会对寄主本身的酸碱值造成一定的改变。

番茄链格孢菌对碳源、氮源的选择不苛刻，常见碳氮源均可使其正常生长，没有规律性可言。对于碳源的选择上，菌株在等量替换成乳糖的查彼固体平板培养基上菌落生长最快，蔗糖次之。在氮源的选择上，菌株在等量替换成酵母膏的查彼固体平板培养基上生长最佳；天冬酰胺则有一定的抑制作用。

[HS2*2][HT8.5H]參考文献：

[1]张天宇. 中国真菌志：第十六卷，链格孢属[M]. 北京：科学出版社，2003.

[2]方仲达. 植病研究方法[M]. 北京：农业出版社，1998.

[3]周晓榕，高翔，王新乐，等. 温度对蜡蚧轮枝菌菌丝生长、产孢量及致病力的影响[J]. 内蒙古农业大学（自然科学版），2005，26（4）：36-38.

[4]席兴文，刘兴强，王其峰，等. 不同氮源培养条件下链格孢菌培养差异初探[J]. 河南农业科学，2009，13（3）：75-76.[LM]

[5][JP3]邹凤莲，汪志平，卢钢. 番红花链格孢菌的分离及其生物学特性研究[J]. 浙江大学学报（农业与生命科学版），2006，32（2）：162-167.[JP]

[6]周舒扬，汪春蕾，乔志新，等. 玉米链格孢叶枯病病原菌的分子鉴定[J]. 中国农学通报，2010，26（11）：261-263.

[7]严进，施宗伟，宋福，等. 河北和山东鸭梨果实上链格孢菌鉴定[J]. 植物保护学报，2009，36（1）：37-43.

[8]崔进龙，郭吉刚，范黎. 远志内生真菌分离鉴定及活性筛选[J]. 微生物通报，2007，34（5）：839-842.

[9]周稚凡，黄伟，谢津，等. 链格孢菌抗植物病原真菌活性筛选[J]. 生物灾害科学，2013，36（3）：265-268.

[10]付娟妮，刘兴华，蔡福带. 石榴采后腐烂病病原菌的分子鉴定[J]. 园艺学报，2005，22（5）：483-487.

[11]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979.

[12]周银丽，白建波，胡先奇，等. 芒果葉斑病病原菌的鉴定及其生物学特性[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：108-109.

[13]罗志文，李向宏. 一种菠萝果病病原初步鉴定及生物学特性研究[J]. 西南农业学报，2014，27（3）：1124-1129.

[14]Winton P W，Bates D H. Saturated solutions for the control of humisity in biological research[J]. Ecology，1960，41（1）：232-237.

[15]Di P P，Cappelli C，Katan T. Vegetative compatibility grouping of Fusarium oxysporum f.sp. gladioli from saffron[J]. European Journal of Plant Pathology，2002，108（9）：869-875.

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