荧光RT-PCR 仪与测序仪在丙型肝炎病毒基因型检测中的应用

张晓丽 东港市中医院检验科 （辽宁 东港 118301）

内容提要：目的：探讨荧光RT-PCR 仪与测序仪在丙型肝炎病毒（HCV）基因型检测中的应用，为临床诊断提供依据。方法：收集2018 年1 月～2020 年2 月86 例明确诊断为丙型病毒性肝炎患者的外周静脉血2mL，分别采用荧光RTPCR 仪和测序仪对血清进行HCV 基因分型测定。结果：荧光RT-PCR 共分型84 例丙型病毒性肝炎患者血清，其中基因1 型56 例（66.7%），非基因1 型28 例（33.3%），2 例分型不确定。测序仪共分型82 例，其中基因1 型59 例（70.2%），均为基因1b 型，非基因1 型23 例（27.3%），包括基因2a 型9 例、3b 型1 例、4a 型2 例、4k 型2 例、6a 型9 例，4 例分型不确定。以测序结果为“金标准”，RT-PCR 基因分型总符合率为93.9%（77/82），其中1 型符合率为96.6%（57/59），非1 型符合率为87.0%（20/23）。结论：测序仪是HCV 患者基因分型的金标准，具有准确度高的特点，但是该测序过程繁琐，耗时长，而荧光RT-PCR 仪同样是检测HCV 基因型的重要方法，其一定程度上可以缩短检测时间，并且也具备较高的准确度。

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是含脂类蛋白包膜的单股正链RNA 病毒,为黄病毒科丙型肝炎病毒属。HCV主要经血和血制品传播，也可通过性传播。急性和慢性丙型肝炎病毒及HCV 无症状携带者为HCV 主要传染源。HCV 感染是全球流行的血源性传播疾病，据世界卫生组织发布的数据显示，全球HCV 感染率达3%，每年新发的丙型肝炎患者多达3.5 万，患病总数达1.7 亿[1]。我国的HCV 感染率约为3.2%。HCV 感染后容易呈慢性化，70%～85%可演变为慢性感染，并有较高的风险发展为肝硬化和肝癌。据报道，慢性丙型肝炎在10～20 年内进展为肝硬化的比例达20%～30%，进展为肝癌的比例达5%[2]。HCV 是为单股正链RNA 病毒，根据基因序列差别通常可将HCV 分为6 型（1～6 型）以及多个亚型，我国的HCV 感染患者以1b 型、2a 型基因居多[3]。了解HCV 基因分型对疾病的感染、诊疗和预防有重要作用，目前可用于检测HCV 基因分型的方法较多，但各有优缺点。本研究探讨荧光RT-PCR 仪与测序仪在丙型肝炎病毒（HCV）基因型检测中的应用价值，报道如下。

1.资料与方法

1.1 临床资料

选择本院2018 年1 月～2020 年2 月86 例丙型肝炎患者，满足标准：抗-HCV 阳性，且HCVRNA≥5 ×103IU/mL，排除甲型肝炎、乙型肝炎等其他病毒感染以及酒精、药物性肝损害等。其中男50 例，女36 例，年龄22～81 岁，平均（40.29±13.28）岁。抽取患者的外周静脉血2mL，分离血清冻存。

1.2 方法

主要试剂与仪器：PTC-200 型荧光PCR 扩增仪（美国MJResearch 公司）；HCV 基因分型检测试剂盒（上海之江科技生物公司）；MagNAPureLC 核酸自动提取仪及配套试剂（瑞士Roche 公司）；3500dx 基因测序仪（美国ABI 公司）等。

荧光RT-PCR 法：①取样。取86 例HCV 感染患者2mL空腹静脉血，以3000r/min 速度，持续离心处理10min，获得血清标本，置于-80 °C 温度冰箱内保存；②核酸提取。血清样本按照QIAampViral RNA Mini Kit 试剂盒说明书进行核酸提取纯化；③PCR 检测。分别取各亚型HCV RT-PCR 反应液38 ×（n+2）μL 和酶系2 ×（n+2）μL，（n 等于首检样本数），混匀，各管分别按40μL/管分装到PCR 反反管中。再在各亚型HCV RT-CR 反应液中分别加入25μL 矿物油。HCV RNA 或质控品的提取产物各10μL。混匀，放入PCR 仪，按下列程序条件扩增：42 °C30min；95 °C 3min；再按94 °C 20S→55 °C 20S→72 °C 30S，循环10 次；再按94 °C 15S → 60 °C 45S，循环30 次。结果判读：①HCV 阴性：管1、管2 中Ct 值均为40 或UNDET；②基因1 型：管1、管2 中Ct 值≤35，且两管差值的绝对值≤3.5；③非基因1 型：管1、管2 中Ct 值≤35，但两管差值的绝对值＞3.5，或管1 中Ct 值≤35，而管2 中Ct为40 或UNDET。

测序法：① HCV-RNA 标本制备。选择德国Qiagen QIAamp 病毒RNA 抽提试剂盒从HCV 感染患者的200μL 血清标本中提取HCV 病毒RNA，将病毒RNA 置于-80 °C 环境下保存待检；②基因扩增。选择HCV 感染患者的HCV NS5B基因区域作为测序重点，扩增方法选择反转录方法。扩增完毕通过扩增曲线判断是否扩增成功。将扩增成功的片段纯化，然后进行测序反应，产物再次纯化后准备上级；③测序。将纯化产物加入96 孔板，过夜检测；④分析。将测序片段提交到NCBI 网站进行基因分型分析（www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）。

1.3 观察指标

统计两种检测方法的基因型检测结果；对比两种检测方法的检测符合率。

1.4 统计学分析

以SPSS23.0 软件进行统计学分析，P＜0.05 为差异显著。

2.结果

RT-PCR 共分型84 例，其中基因1 型56 例（66.7%），非基因1 型28 例（33.3%），2 例分型不确定。测序仪共分型82例，其中基因1 型59 例（70.2%），均为基因1b 型，非基因1型23 例（27.3%），包括基因2a 型9 例、3b 型1 例、4a 型2 例、4k 型2 例、6a 型9 例，4 例分型不确定。以测序结果为“金标准”，RT-PCR 基因分型总符合率为93.9%（77/82），其中1型符合率为96.6%（57/59），非1 型符合率为87.0%（20/23）。

3.讨论

HCV 感染呈世界性分布，全世界至少有2 亿HCV 感染者。国外丙肝病毒的感染率在1%～1.4%。HCV 是输血后肝炎和散发性非甲非乙型肝炎的主要病原。HCV 感染持续时间可达20～30 年，并可进一步发展为慢性活动性肝炎和肝硬化；在许多国家，HCV 已成为肝细胞癌的主要病因[4]。由于对血液制品的严格筛选和相关危险行为矫正，近年呈流行下降趋。我国为HCV 中高度感染区，感染率仅次于乙型肝炎。约5%的人患丙型肝炎，占输血后肝炎的78%～94%，占散发性肝炎的24%。前瞻性研究表明，约60%～80%的丙型肝炎感染者发展为慢性肝炎，其中约25%最终发展为肝硬化或肝癌[5]。HCV 基因具有高度的异源性与变异性，在基因组各域都可发生变异位点。HCV 基因不同分型可表现出不同的生物学特性，如病毒的复制能力、致病能力以及对治疗药物的敏感度等[6]。HCV 基因型的分布存在地理性差异，亚洲国家以1b 型更常见，美国以1a 型更常见，北美和欧洲以2a、2b型更常见[7]。我国1～6 型基因均有分布，其中最多的当属1b型，在南方1b 型可占到90%及以上，其次常见的就是2a 型，北方居多。可见，我国不同地区、不同人群的HCV 基因型及亚型分布存在着很大差异。

HCV RNA 属于黄病毒家族的正链RNA 病毒，其感染的最大特点是极易演变为慢性，并可进一步发展为肝硬化。目前干扰素为治疗的主要药物，但其价格昂贵且疗效不确切，而且在丙型肝炎抗病毒治疗中的剂量、疗程、适应症等方面无确定的统一指标。研究结果一致证明：患者血清中病毒含量不仅能反映疾病进程和肝损伤程度，还能较好地预测、指导和评价干扰素治疗[8]。据报道，HCV2 型、3 型基因患者经利巴韦林联合干扰素治疗1 年，持续病毒学应答的比例可达到70%～80%，而1 型、4 型基因患者仅为40%～50%[9]。

因此，应用HCV RNA 水平监测干扰素治疗过程远比用ALT 水平更为合适，能够帮助医生制定抗病毒治疗的个体化方案。且临床研究发现，绝大多数ALT 正常而HCV RNA 阳性的患者实际上患有慢性活动性肝炎。因此了解患者体内的HCV RNA 水平对于了解病变程度、特别是预测、评价干扰素治疗反应、制定疗程有十分重要的意义，同时也使丙型肝炎发病机制的研究进入量化阶段[10]。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA 扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR 是在PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的CT 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。实时荧光定量PCR 常见的检测方法包括SYBRGreenⅠ法及TaqMan 探针法，前者是在PCR 反应体系中，加入过量SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。后者则是探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物的形成完全同步。DNA 测序仪的工作原理主要基于Sanger 发明的双脱氧链末端终止法或Maxam-Gilbert 发明的化学降解法。这两种方法在原理上虽然不同，但都是根据在某一固定的位点开始核苷酸链的延伸，随机在某一个特定的碱基处终止，产生以A、T、C、G 为末端的四组不同长度的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片段的分离和检测，从而获得DNA 序列。由于双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，因此在单纯以测定DNA 序列为目的的全自动DNA 测序仪中应用广泛。而化学降解法在研究DNA 的二级结构以及蛋白质-DNA 相互作用中具有重要的应用价值。双脱氧链末端终止法测序是利用DNA 的体外合成过程-聚合酶链反应，在DNA 聚合酶的催化作用下，以目的DNA 为模板，按照碱基互补配对原则，在引物的引导下完成。普通的PCR 反应体系中，加入的核苷酸单体为4 种2'-脱氧核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)。测序反应体系中，加入的核苷酸单体为2',3 双脱氧核苷三磷酸( ddNTP)。与dNTP 相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少个羟基，反应过程中虽然可以在DNA 聚合酶作用下，通过其磷酸基团与正在延伸的DNA 链的末端脱氧核糖-OH 发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA 链中，但它们本身没有-OH，不能同后续的dNTP 形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA 链在此终止。

本研究检测了该地区86 例HCV 感染者的基因型。目前HCV 基因型的检测方法较多，测序法被认为是HCV 基因分型的“金标准”，但是成本较高，操作复杂，技术要求高，无法在临床上广泛开展。近些年出现了一些新的检测方法，如型特异性引物PCR 法、异源分子迁移率法、型特异性探针核酸杂交分析法、限制性片段长度多态性分析法等，但仍旧操作繁琐、成本高，并且灵敏性、特异性不一，尚不能完全满足临床需求[11]。有报道显示，荧光RT-PCR 法的灵敏性、特异性很高，而且操作简便，成本较低，重复性好，推荐成为检测HCV 基因分型的优选方法[12]。本研究结果显示，86 例HCV 基因分型，1b 型占多数，RT-PCR 共分型84 例，测序法4 例分型不确定。以测序结果为“金标准”，PCR 基因分型总符合率为93.9%，其中1 型符合率为96.6%，非1 型符合率为87.0%。可见，RT-PCR 法对HCV 基因分型的可靠性高，有望在临床上广泛开展。