黄芩炭饮片质量标准研究

陈智

山东中医药大学药学院，济南 250355

黄芩，别名土金茶根、黄金茶，为唇形科植物黄芩（Scutellɑriɑ bɑicɑlensisGeorgi）的干燥根，用药历史悠久，是中医临床最常用的中药之一，始载于《神农本草经》［1］。炮制历史沿革研究表明，清热多用生黄芩，能清肺胃胆及大肠经之湿热，用于肺热咳嗽、热病烦渴、咽喉肿痛；止血多用黄芩炭，用于血热吐衄，治疗火毒炽盛、迫血妄行的血热出血证［2-4］。黄芩化学成分主要包括黄酮类化合物、挥发油、多糖等化学成分，又以黄酮类成分含量最高。现代研究已经从不同种类的黄芩中提取分离出黄酮类化合物120余种，其中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等被认为是黄芩的特征化学成分，是控制黄芩及黄芩制剂质量的重要指标［5-6］。黄芩制炭后药性变缓，黄芩在炒炭过程中黄芩苷分解成其苷元黄芩素，苷类含量与黄酮总含量显著下降，黄芩素含量明显增加［7］。本研究在《山东省中药饮片炮制规范（2012年版）》［8］的基础上，参照《中国药典（2020年版）》一部［9］，对黄芩炭炮制规范标准进行完善和提高，增加了水分、总灰分检查项，浸出物检查项以及黄芩炭的特征图谱，以增强黄芩炭质量标准的可控性。

仪器与材料

1.实验器材

1260高效液相色谱仪（Agilent Technologies Inc，DAD）；岛津U-2550紫外分光光度计；OS540红外温度测量仪（OMEGA）；BS110S电子分析天平；河南予华循环水式多用真空泵；上海亚荣RE-52A旋转蒸发仪。

2.主要药品与试剂

汉黄芩素对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号T11J11R108209）；黄芩素对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号C20M8Y31962）；黄芩苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号Z28S11X125952）；汉黄芩苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号A09GB144759）；乙腈和甲醇为色谱纯级，其他试剂为分析纯级；娃哈哈纯净水。

黄芩药材（编号S1～S10，具体来源信息见表1），经山东中医药大学徐凌川教授鉴定为唇形科属植物黄芩Scutellɑriɑ bɑicɑlensisGeorgi的干燥根。上述药材分别置热锅内，武火炒至表面黑褐色，内部黄褐色，喷淋清水少许，灭尽火星，取出，及时摊晾，凉透。

方法与结果

1.性状鉴别

本品为类圆形或不规则形段或片，片面黑褐色，内部黄褐色，质松脆。有焦糊气，味苦。结果见图1。

图1 黄芩炭性状鉴别图（编号S3）

2.薄层色谱（TLC）鉴别

供试品溶液的制备：取本品粉末1 g，加乙酸乙酯-甲醇的混合溶液30 ml，加热回流30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 ml使溶解，取上清液作为供试品溶液。点样2 µl。

对照品溶液的制备：取黄芩素对照品、汉黄芩素对照品，分别加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。点样1 µl。

黄芩对照药材溶液的制备：取本品粉末1 g，加乙酸乙酯-甲醇的混合溶液30 ml，加热回流30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 ml使溶解，取上清液作为供试品溶液。点样2 µl。

薄层板：浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂出品，规格10 cm×20 cm，批号为202005。展开剂：甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）。展开条件：温度25 ℃，相对湿度70%。检视：紫外光灯（365 nm）。

结果：供试品色谱中，黄芩炭与对照品及黄芩对照药材色谱相应的位置上，显两个相同的暗色斑点，见图2、3。

图2 黄芩炭的薄层色谱（TLC）鉴别图谱。1为黄芩素对照品，2为汉黄芩素对照品，3～5为S1至S3样品，6为黄芩对照药材

图3 10批黄芩炭的薄层色谱（TLC）鉴别图谱。1、8为黄芩素对照品，2、9为汉黄芩素对照品，3～7为S1至S5样品，10～14为S6至S10样品

3.水分、总灰分、醇溶性浸出物检测

3.1.水分 黄芩所含成分主要以黄酮类为主，经过制炭之后的炮制品，少含挥发性化学成分，因此参照《中国药典（2020年版）》通则0832第二法测定，每批样本平行测定3次，取3次平均值，结果见表2。结果显示，10批黄芩炭水分为2.60%～7.36%，平均值为5.20%。炭药吸水性较强，根据样品测定结果，结合储藏过程中对水分控制的要求，拟定黄芩炭水分不得超过10.0%。

表2 黄芩炭水分、总灰分、醇溶性浸出物测定结果（%，n=3）

3.2.总灰分 取各批次黄芩炭药材粉末，参照《中国药典（2020年版）》通则2302测定总灰分，每批样品平行测定3次，取3次测定平均值，结果见表2。10批黄芩炭总灰分为5.03%～8.92%，平均值为6.39%。根据样品测定结果，拟定黄芩炭总灰分不得超过10.0%。

3.3.醇溶性浸出物 取各批次黄芩炭药材粉末，照醇溶性浸出物测定方法（《中国药典（2020年版）》通则2201）项下的热浸法测定，每批样品平行测定3次，取3次测定平均值，结果见表2。10批黄芩炭醇溶性浸出物为23.08%～48.92%，平均值为32.84%。根据样品测定结果，拟定黄芩炭醇溶性浸出物不得少于20.0%。

4.特征图谱

黄芩中主要含有黄酮类成分，根据前期实验结果表明，黄芩炒炭后，苷类成分向苷元成分转化，结果见图4、5，有必要对黄芩炭炮制前后苷及苷元成分进行特征图谱研究。

图4 黄芩苷模拟炮制后成分变化

图5 汉黄芩苷模拟炮制后成分变化

4.1.对照品溶液的制备 分别精密称定4种对照品（黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素）适量，甲醇定容，配得黄芩苷对照品溶液（0.400 mg/ml）、黄芩素对照品溶液（0.416 mg/ml）、汉黄芩苷对照品溶液（0.204 mg/ml）、汉黄芩素对照品溶液（0.200 mg/ml）。

4.2.供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约1 g，精密称定，转移至具塞锥形瓶中，精密加入50 ml 70%乙醇，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4.3.色谱条件 安捷伦1260高效液相色谱仪，色谱分析柱Diamonsil C18（250×4.6 µm，5 µm）；检测波长275 nm；柱温30 ℃；进样量10 µl；设定A相为1%甲酸水溶液、B项甲醇，流动速度为1 ml/min，梯度洗脱（0～10 min，80%～60%A；10～20 min，60%A；20～30 min，60%～54%A；30～45 min，54%A；45～50 min，54%～50%A；50～80 min，50%～20%A）。

4.4.方法学考察

4.4.1.精密度考察 连续6次精密进样10 µl混合对照品溶液，得各峰面积的相对标准差（RSD）分别为0.29%、0.48%、0.53%、0.74%（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素）。

4.4.2.稳定性考察 取同一份供试品溶液，每放置2 h测定一次，共6次，得各峰面积的RSD分别为0.67%、0.46%、0.77%、0.43%（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素），表明12 h内各指标成分未被明显破坏。

4.4.3.重复性考察 精密称定黄芩炭粉末约2 g，共取6份，按照生黄芩待测品制备条件制得样品溶液，各RSD分别为0.89%、1.53%、1.97%、0.91%（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素），表明实验有较好重现性。

4.4.4.加样回收率 取已测知黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量的黄芩炭样品约0.1 g，精密称定，共取6份，转移至50 ml量瓶中，在每一份样品中精密加入黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品溶液适量，加50%甲醇适量，超声处理30 min，放冷，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述测定方法进行测定，计算回收率，结果见表3。

表3 加样回收率实验结果

4.5.不同批次黄芩炭指纹图谱建立及相似度评价 将10批黄芩炭供试品高效液相色谱法（HPLC）图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，设定S1为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度为0.1，进行多点校正，进行匹配，生成对照图谱（R），结果见图6。经过加入对照品，比对保留时间，共指认了3个色谱峰，分别为1号色谱峰黄芩苷、2号色谱峰黄芩素、3号色谱峰汉黄芩素，结果见图7。

图6 10批次黄芩炭生成对照图谱

图7 10批次黄芩炭特征图谱

5.含量测定

黄芩炒炭后，其黄芩苷的含量会降低，会部分转化为黄芩素。但是黄芩炒炭要求“炒炭存性”，为了反映和控制黄芩炭的内在质量，建立黄芩炭中黄芩素的HPLC含量测定方法。

5.1.供试品的制备 取本品粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 ml，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5.2.对照品溶液的配制 取黄芩素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，即得。

5.3.色谱条件 选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53）为流动相；检测波长275 nm，理论板数以黄芩素峰计不低于5 000。柱温：35 ℃，流速：1.0 ml/min。按此色谱条件进行实验，色谱峰分离条件好，见图8、9。

图8 黄芩素对照品高效液相色谱法（HPLC）色谱图

图9 黄芩炭样品高效液相色谱法（HPLC）色谱图

5.4.线性关系的考察 配置对照品溶液（C对为1 mg/ml）2倍比依次稀释，得不同浓度黄芩素对照品溶液，分别吸取10 µl注入液相色谱仪，按照上述色谱条件分别测定。以黄芩素对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程y=4 514 000x+17 648，相关系数r=0.999 5。试验结果表明，黄芩素进样量在0.312 5～10 µg之间与峰面积呈良好的线性关系。

5.5.方法学考察 实验结果表明，仪器精密度良好，平均RSD为0.64%；实验方法重复性良好，RSD为1.83%；供试品溶液在12 h内稳定性良好，加样回收率符合要求。

5.6.样品测定 分别精密称取10批黄芩炭粉末各1 g，按4.2项下方法制备供试品溶液，在5.3项下色谱条件检测，计算样品含量，结果见表4。10批样品中黄芩素的含量均大于1%，且黄芩素含量与炒炭过程中饮片的碳化程度有很大关系。考虑市场样品的情况，暂规定：本品按干燥品计算，含黄芩素不得少于1.0%。

表4 10批黄芩炭黄芩素含量测定结果（%，n=3）

讨论

本研究对黄芩炭饮片进行了定性鉴别和水分、总灰分、醇溶性浸出物测定，并对其中黄芩素含量进行了测定，并根据黄芩中黄酮类成分的变化，制定了黄芩炭的特征图谱，初步拟定了各指标的限度标准，使黄芩炭饮片的标准制备更符合临床应用实际。本研究使黄芩炭饮片的质量标准更加完善，能够达到全面控制黄芩炭饮片质量的目的，为黄芩炭饮片的止咳控制提供了可靠有效的手段。

黄芩苷、黄芩素等黄酮类成分是黄芩中主要药效成分，在黄芩及其制剂中作为主要质量控制指标［10-11］。原标准黄芩炭仅以黄芩素作为对照进行鉴别，方法专属性不强。而中药制炭过程中要求“炒炭存性”，黄芩炭中除黄芩素以外，还含有多种苷类成分及苷元成分，故应对其进行整体质量控制。制定黄芩炭特征图谱中发现，炭化程度对黄芩中苷元成分影响较大，尤其是随着炭化程度的增加，汉黄芩苷含量显著下降，部分样品中汉黄芩苷含量已降至检测限以下，故特征图谱中未对汉黄芩苷进行标定。

通过实验发现，不同产地、不同种植条件下收集的黄芩炭各成分含量差异较大，这可能是药材产地气候环境、生长年限等原因所致［12-13］。另外，在制备黄芩炭过程中，炒制火力、炭化程度的不同也是造成各批次之间各成分含量差异的重要原因。为更加科学有效完善黄芩炭质量标准，后续课题组将继续扩大样本收集范围，并完善黄芩炭最佳炮制工艺。

利益冲突作者声明不存在利益冲突