基于HPLC 指纹图谱结合化学计量学的痢泻灵片质量评价

2023-09-19于密密王安琪杜小伟王京辉张文婷陈有根傅欣彤郭洪祝

中成药 2023年9期

于密密，王安琪，杜小伟，王京辉，张文婷，陈有根，傅欣彤，郭洪祝

（北京市药品检验研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京 102206）

痢泻灵片由拳参、穿心莲、苦参3 味中药组成，具有清热解毒、止痢、止泻功效，临床上用于治疗湿热痢疾、热泻等疾病，现收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第二册，但仅有检查项，并且目前关于该制剂质量控制和评价方法的报道较少［1-2］。因此，亟需完善痢泻灵片质量标准以保障其临床疗效［3-8］。

指纹图谱可全面、整体地表征中药复方成分特征，是中药制剂质量控制、一致性评价的有效手段，而化学计量学通过对指纹图谱中复杂的中药化学数据信息进行综合分析和处理，可更全面地反映中药成分特征。另外，以多种指标成分或有效成分为对象建立的质量标准更符合中药制剂特点，也更真实全面地反映其质量［9-10］。

本实验抽取全国3 个厂家30 批痢泻灵片，建立该制剂HPLC 指纹图谱，再结合主成分分析、聚类分析、正交偏最小二乘分析考察不同厂家、批次样品的质量差异，并对所筛选出的质量差异标志物进行含量测定［11-13］，以期为该制剂质量标准提升提供参考。

1 材料

1.1 仪器 LC-20A 型高效液相色谱仪，配置PDA检测器（日本岛津公司）；CP225D 型电子分析天平（十万分之一，德国赛多利斯公司）；SB-25-12DT 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；SevenEasy PH 计［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；Milli-Q 超纯水系统（德国默克股份有限公司）。

1.2 试剂与药物没食子酸（批号110831-201906，纯度91.5%）、苦参碱（批号110805-202010，纯度 98.7%）、氧化苦参碱（批号110780-201909，纯度92.9%）、槐果碱（批号112052-202001，纯度91.8%）、氧化槐果碱（批号111652-202202，纯度93.1%）、儿茶素（批号110877-202005，纯度95.1%）、绿原酸（批号110753-202119，纯度96.3%）、穿心莲内酯（批号110797-202010，纯度99.6%）对照品及拳参（批号 121569-201602）、穿心莲（批号 121082-201706）、苦参（批号121019-201708）对照药材（中国食品药品检定研究院）。痢泻灵片共30 批，来源于3 家生产企业（A、B、C），编号P1～P30。番石榴酸（批号18935，纯度99.8%，深圳市江川医药技术有限公司）。甲醇为色谱纯（德国默克公司）；磷酸为优级纯，磷酸二氢钾、甲醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 XSelect CSH C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相甲醇（A）-0.2%磷酸二氢钾（磷酸调节pH 为3.0）（B），梯度洗脱（0～20 min，5%～20% A；20～25 min，20% A；25～35 min，20%～25% A；35～40 min，25% A；40～90 min，25%～90%A；90～100 min，100%A）；体积流量0.5 mL／min；柱温30 ℃；检测波长0～45 min 215 nm，45～60 min 300 nm，60～80 min 215 nm；进样量5 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液取没食子酸、苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、番石榴酸、儿茶素、绿原酸、穿心莲内酯对照品适量，40%甲醇制成质量浓度分别为 0.02、0.1、0.05、0.02、0.02、0.2、0.02、0.1、0.2 mg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液取本品20 片或除去包衣研细，精密称取1.0 g，精密加入40% 甲醇25 mL，称定质量，超声处理45 min，取出，放冷，40%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 对照药材溶液精密称取拳参、穿心莲对照药材各0.3 g，按“2.2.2” 项下方法制备，即得相应溶液。精密称取苦参对照药材0.4 g，加15 mL水加热回流提取1 h，取出，放冷，以铺有少量脱脂棉的漏斗过滤，滤液浓缩至约1 mL，再加入40%甲醇25 mL，按“2.2.2” 项下方法制备，即得相应溶液。

2.2.4 阴性样品溶液按本品处方比例，分别制成缺拳参、缺穿心莲、缺苦参的阴性样品，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3 HPLC 指纹图谱建立

2.3.1 精密度试验取同一批样品（P22），按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，以绿原酸为参照，测得各共有峰相对峰面积RSD＜2.0%，相对保留时间RSD＜2.0%，每2 针之间的相似度为1.000，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验取同一批样品（P22），按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，以绿原酸为参照，测得各共有峰相对峰面积RSD＜2.0%，相对保留时间RSD＜2.0%，每2 针之间的相似度为0.999～1.000，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验取同一批样品（P22），按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，于0、4、10、16、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，以绿原酸为参照，测得各共有峰相对峰面积RSD ＜2.0%，相对保留时间RSD＜2.0%，每2 针之间的相似度为0.999～1.000，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.4 图谱生成取30 批样品，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统” 软件（2012 年版），设定时间窗宽度为0.1 min，采用平均数法生成对照指纹图谱，见图1A，将其（S1）和色谱峰较多、信号较强、峰面积较大的P2、P7～P8、P11～P12、P14～P16、P20～P22、P24、P28～P29 （S2～S15）生成指纹图谱，见图1B。再采用多点校正对色谱峰进行匹配，发现17 个共有峰，各批样品相似度见表1。

表1 30 批样品相似度Tab．1 Similarities of thirty batches of samples

图1 痢泻灵片对照指纹图谱（A）及HPLC 指纹图谱（B）Fig．1 Reference fingerprint （A） and HPLC fingerprints（B） for Lixieling Tablets

2.3.5 共有峰归属取供试品（P22）、对照药材、阴性样品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图2，根据“2.3.4” 项下结果对17 个共有峰进行编号，通过比对药材图谱及其阴性图谱并结合色谱峰保留时间，发现1 号峰（苦参碱）、4 号峰（槐果碱）、6 号峰（氧化槐果碱）、7 号峰（氧化苦参碱）、8 号峰（番石榴酸）、15 号峰来自苦参，2 号峰（没食子酸）、3 号峰、5号峰、9 号峰、10 号峰（儿茶素）、11 号峰、12号峰（绿原酸）峰来自拳参，12 号峰（绿原酸）、13 号峰、14 号峰、16 号峰（穿心莲内酯）、17 号峰来自穿心莲。

图2 HPLC 指纹图谱共有峰Fig．2 Common peaks in the HPLC fingerprints

2.4 化学计量学研究

2.4.1 系统聚类分析（HCA）以共有峰峰面积为原始数据，生成30×30 阶数据矩阵，采用IBM SPSS Statistics 19.0 软件进行HCA 分析，结果见图3。由此可知，当平方欧式距离为25 时，可将30批样品聚为3 类，其中企业A 的P1、P3～P6 和企业B 的P17～P19 聚为一类，企业B 的P13～P16、P20～P22 和企业C 的P26～P30 聚为一类，企业A的P2、P7～P12 和企业C 的P23～P25 聚为一类，结合“2.3.4” 项下结果，发现第1 类样品相似度最低，第3 类样品最高。

图3 30 批痢泻灵片HCA 树状图Fig．3 HCA dendrogram of thirty batches of Lixieling Tablets

2.4.2 主成分分析（PCA）以共有峰峰面积为变量，导入SIMCA 14.1 软件进行PCA 分析，结果见图4。由此可知，累积解释能力参数R2X、R2Y分别为0.987、0.788，均大于0.5，表明模型稳定可靠，其中P2、P13～P22 聚为一类，P23～P30、P8～P11 聚为一类，P1、P3～P7、P12 聚为一类，与“2.4.1” 项下结果基本一致。

图4 30 批痢泻灵片PCA 得分图Fig．4 PCA score plot for thirty batches of Lixieling Tablets

2.4.3 正交偏最小二乘法-判别分析（OPLSDA）将共有峰峰面积导入SIMCA 14.1 软件，进行OPLS-DA 分析，结果见图5，可知所有批次样品均落在置信区间内，可按照来源精确地被分为3类，并且组内差异较小。在α＝0.95 置信区间内，以变量投影重要性（VIP）＞1.0 的色谱峰为差异标志物，见图6，按VIP 值从大到小排序，依次为峰8 （番石榴酸）、峰15、峰10 （儿茶素）、峰16（穿心莲内酯）、峰12 （绿原酸）、峰3、峰2 （没食子酸），其中有2 个峰（峰8、峰15）来自苦参，4 个峰（峰2、峰3、峰10、峰12）来自拳参，2 个峰（峰12、峰16）来自穿心莲，可能为引起痢泻灵片质量差异的主要变量。

图5 30 批痢泻灵片OPLS-DA 得分图Fig．5 OPLS-DA score plot for thirty batches of Lixieling Tablets

图6 OPLS-DA VIP 值Fig．6 VIP values of OPLS-DA

2.5 主要成分含量测定采用HPLC 法。

2.5.1 色谱条件同“2.1” 项。

2.5.2 线性关系考察分别精密吸取番石榴酸（0.209 6 mg／mL）、儿茶素（0.211 5 mg／mL）、绿原酸（0.104 7 mg／mL）、没食子酸（0.004 69 mg／mL）、穿心莲内酯（0.193 6 mg／mL）对照品溶液1、2、5、10、15 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab．2 Linear relationships of various constituents

2.5.3 专属性试验取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1” 项下色谱条件进样测定，结果见图7。由此可知，除了绿原酸为拳参、穿心莲共有成分外，其余成分色谱峰均无干扰，表明该方法专属性良好。

图7 各成分HPLC 色谱图Fig．7 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.4 精密度试验取“2.5.2” 项下对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定5 次，每次5 μL，测得没食子酸，番石榴酸，儿茶素，绿原酸、穿心莲内酯峰面积RSD 分别为0.67%、0.15%、0.09%、0.13%、0.12%，表明仪器精密度良好。

2.5.5 重复性试验取同一份本品（P22），按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、番石榴酸、儿茶素、绿原酸、穿心莲内酯含量RSD 分别为 1.03%、0.89%、0.93%、0.25%、0.74%，表明该方法重复性良好。

2.5.6 稳定性试验取同一份供试品溶液（P22），于0、4、10、16、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、番石榴酸、儿茶素、绿原酸、穿心莲内酯峰面积RSD 分别为2.06%、1.87%、1.51%、0.83%、1.44%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.7 加样回收率试验精密称取各成分含量已知的同一份本品（P22） 6 份，每份0.5 g，精密加入“2.2.1” 项下对照品溶液适量，按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、番石榴酸、儿茶素、绿原酸、穿心莲内酯平均加样回收率分别为103.1%、97.29%、101.4%、104.0%、100.8%，RSD 分别为1.09%、0.63%、1.54%、0.44%、1.66%。

2.5.8 样品含量测定取30 批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。