超声波辅助酶法提取油茶粕蛋白工艺优化及其功能活性

朱静，吕静，陈龙，陈亚蓝

（信阳农林学院，河南 信阳 464000）

油茶（Camellia oleifera Abel）别名茶子树，具有种植历史悠久、分布广泛、栽培面积大、用途广泛等特性[1]。我国是世界上主要油茶产品生产地之一，主要集中在河南、浙江、江西、湖南、江西等地，到2025 年，全国年产量预计可达200 万t，随之产生的废弃物也数量巨大，其中油茶籽粕（Camellia oleifera seed-cake，COS）由30%～60%多糖、10%～20%蛋白质、0.5%～7.0%粗脂肪、12%～18%茶皂素和15%～25%粗纤维等成分组成，具有很高的利用价值[2]，但目前对于油茶副产物的综合利用相对匮乏，只有少量COS 用于燃料、肥料和饲料，造成了一定的资源浪费。

COS 所含蛋白质按照Osborne 分类法主要包括清蛋白、球蛋白、醇溶性蛋白以及谷蛋白，其中的清蛋白、醇溶性蛋白以及谷蛋白具有较强的抗氧化活性[3]。COS 含有大量人体必需氨基酸，为潜在的优质植物蛋白资源[4]。研究表明，油茶籽粕粗蛋白（Camellia oleifera seed-cake crude protein，COCP）及其水解物还具有降血压、降血脂、抗氧化等功能特点。李婷婷等[5]发现油茶籽糖蛋白能显著清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基，具有一定的抗氧化能力。李慧珍等[3]从油茶饼粕中分离纯化蛋白质得到分离蛋白组分，发现其具有一定的抗氧化活性及金属离子螯合能力。龚吉军等[6]通过动物实验发现，油茶籽粕多肽能够显著降低高血脂模型大鼠血清中总胆固醇与甘油三酯的含量、动脉硬化指数，还能有效提高高密度脂蛋白胆固醇的水平，结果表明油茶粕多肽具有良好的降血脂功效。目前COCP 的提取方法主要有碱溶酸沉法、酶法、超声波辅助提取法。其中最常用的方法是碱溶酸沉法，这种方法具有操作简单、成本低等特点，较为适合工业化生产，但蛋白质的提取率较低[7]；酶法是对油茶粕蛋白进行适当的酶解预处理，去除与蛋白结合或反应的糖类物质、提高油茶粕蛋白的提取率，但是消耗时间久[8]；超声波辅助提取法是利用超声波作用粉碎植物细胞，释放内容物，能够解决水溶法提取时间长、效率低等问题[9]。安宇等[10]研究发现超声波处理对芸豆蛋白质的抗氧化能力有显著性影响。

本文采用超声波辅助酶解的方法提取COCP，并初步探究该法所得的醇溶性粗蛋白对羟自由基、DPPH自由基、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2' -azino -bis -（3 -ethylbenzothiazoline -6 -sulfonic acid），ABTS] 阳离子自由基的清除能力以及其降脂特性，以期为COCP 的应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

油茶籽粕：信阳崧润茶油有限公司；低温α-淀粉酶（50 U/mg）、纤维素酶（≥400 U/mg）、胆固醇酯酶（150 U/mg）、胰脂肪酶（3 万U/g）、考来烯胺：上海源叶生物科技有限公司；石油醚、95%乙醇、盐酸：郑州派尼化学试剂厂。所有试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

超声波细胞破碎仪（Scientz-IID）：宁波新芝生物科技有限公司；冷冻干燥机（FD-1A-80）：上海比朗仪器制造有限公司；凯氏定氮仪（ST-04）：山东盛泰仪器有限公司；紫外分光光度计（A390）：翱艺仪器（上海）有限公司；电热恒温水浴锅（DZKW-0-2）：北京市永光明医疗仪器有限公司；低速离心机（TDL-40B）：上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

油茶籽粕蛋白提取工艺流程图见图1。

图1 COCP 提取工艺流程图Fig.1 COCP extraction process flow

1.3.1 酶处理单因素试验

参考张新昌等[8]的方法，对COS 进行干燥粉碎，采用石油醚脱脂、乙醇脱皂后得到试验原料。以酶解时间60 min、酶解温度50 ℃、每100 g 原料添加1.0%淀粉酶与0.3%纤维素酶、酶解pH4.5 为固定条件，考察酶解时间（30、60、90、120、150 min）、酶解温度（45、50、55、60、65 ℃）、淀粉酶与纤维素酶添加量（0.5%和0.1%、1.0%和0.3%、1.5%和0.5%、2.0%和0.7%、2.5%和0.9%）、酶解pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）对COCP回收率的影响。

1.3.2 正交试验

在单因素试验的基础上，选取酶解时间（A）、酶解温度（B）、酶添加量（C）、酶解pH 值（D）进行L9（34）正交试验，优化UEAE 法提取蛋白的工艺条件，因素水平设计见表1。

表1 正交试验设计Table 1 Design for orthogonal test

1.3.3 超声处理单因素试验

参照范东斌等[9]的方法，取100 g 酶预处理后的原料粉末，添加70%乙醇，料液比1∶40（g/mL），超声波功率（250、300、350、400、450 W），超声时间（20、40、60、80、100 min），将滤渣进行3 次浸提后，合并滤液并静置过夜，再过滤1 遍后进行酸沉，将沉淀物冷冻干燥，即可得到COCP。

1.3.4 COCP 回收率

COCP 回收率（S，%）计算公式如下。

式中：m 为所得COCP 质量，g；M 为COS 中粗蛋白含量，g

依据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法，检测得出本文所采用的油茶饼粕的粗蛋白含量为16.8%。

1.3.5 COCP 抗氧化能力测定

1.3.5.1 羟自由基（·OH）清除能力测定

参照胡平平[11]的方法，测定COCP 对羟自由基的清除能力，羟自由基清除率（X1，%）计算公式如下。

式中：A0为空白组吸光值；A1为无双氧水对照组吸光值；A2为试验组吸光值。

1.3.5.2 DPPH 自由基清除能力测定

根据祝子坪等[12]的方法，准确配制浓度为50 mg/mL的COCP 溶液及50 mg/mL 的维生素C 溶液，分别进行DPPH 自由基清除试验。DPPH 自由基清除率（X2，%）计算公式如下。

式中：A0为空白组吸光值；A1为试验组吸光值；A2为无水乙醇对照组吸光值。

1.3.5.3 ABTS+自由基清除能力测定

根据马雅鸽等[13]的方法，ABTS+自由基清除率（X3，%）计算公式如下。

式中：A1为样品吸光值；A0为空白对照吸光值。

1.3.6 COCP 降脂功能测定

1.3.6.1 胆酸钠结合能力测定

参照张煜[14]的研究方法，略作修改。分别吸取10、20、30、40、50 μL 的0.05 mg/mL COCP 溶液于25 mL 具塞试管中，向其中加入磷酸盐缓冲溶液6 mL，然后加入4 mL 由磷酸盐缓冲液配制成的0.6 mmol/L 甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠溶液，在37 ℃条件下振荡2 h 后，4 000 r/min 离心20 min，然后收集上清液。取2.5 mL 上清液，加入7.5mL 的60%硫酸溶液；在70 ℃水浴20 min，取出之后立即冰浴5 min，在387 nm 测定其吸光值。胆酸盐吸附试验以考来烯胺作为阳性对照。

1.3.6.2 胰脂肪酶抑制率测定

根据段振[15]和苏建辉[16]的方法，胰脂肪酶抑制率（Y1，%）计算公式如下。

式中：A 为空白管消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；B 为空白对照管消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；C 为样品管消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；D 为背景对照管消耗氢氧化钠溶液的体积，mL。

1.3.6.3 胆固醇酯酶抑制率测定

参考文献[16]的方法测定胆固醇酯酶抑制率。底物4-硝基苯基丁酸酯用乙腈预先溶解配制，并进行冷冻保存。COCP 及胆固醇酯酶提前用高纯水进行溶解，加入4-硝基苯丁酸酯液，其反应在pH7.0 磷酸盐缓冲液中进行。25 ℃恒温反应5 min，然后静置3 min 于405 nm 处测定其吸光值。配制方法见表2。

表2 胆固醇酯酶活性抑制体系Table 2 Inhibition system of cholesterol esterase activity

胆固醇酯酶抑制率（Y2，%）计算公式如下。

式中：A0为空白管吸光值；A1为空白对照管吸光值；A2为背景对照管吸光值；A3为抑制剂管吸光值。

1.4 数据分析

所有数据采用office 2010 软件进行作图分析，SPSS 21.0 软件进行ANOVA 分析。

2 结果与分析

2.1 酶解条件单因素对COCP 回收率的影响

不同酶解条件对COCP 回收率的影响见图2。

图2 酶解条件对COCP 回收率的影响Fig.2 Effect of enzymatic conditions on COCP recovery rate

由图2A 可知，随着酶解时间的延长，COCP 回收率随之增加。在酶解时间为150 min 时，COCP 回收率达到最高，为（74.1±1.3）%。当酶解时间为120 min 时，COCP 的回收率为（72.5±1.4）%，与酶解时间为150 min 时的回收率无显著性差异。为了节约能源以及缩短生产周期等，选择酶解时间90、120、150 min 进行正交试验。

由图2B 可知，随着酶解温度的升高，COCP 回收率呈先上升后下降趋势，在45～50 ℃时，COCP 回收率随着酶解温度的升高而升高，当酶解温度为50 ℃时，COCP 回收率为最高，达到（74.2±1.4）%。但是随着酶解温度的继续升高，酶在高温条件下，部分酶变性失活，活性逐渐降低[8]，随之COCP 的回收率也逐渐降低。由此可以看出，COS 酶预处理过程中温度的控制尤为关键，选择酶解温度45、50、55 ℃进行正交试验。

由图2C 可知，在淀粉酶和纤维素酶添加量分别为0.5%和0.1%时，COCP 的回收率为（63.4±1.3）%，随着酶添加量的增加，COCP 回收率明显上升；在淀粉酶和纤维素酶添加量为2.0%和0.7%时，COCP 回收率较高，为（76.8±1.0）%，继续增加酶添加量，回收率增幅不显著。综合考虑，选择淀粉酶与纤维素酶添加量为1.5%和0.5%、2.0%和0.7%、2.5%和0.9%进行正交试验。

由图2D 可知，COCP 回收率为先上升后下降趋势。在酶解pH4.5 时，COCP 回收率达到最大值，为（77.9±1.3）%。在pH 值大于4.5 时，随着pH 值的逐渐增加，酶的活性也逐渐减小（已报道淀粉酶最适pH4.5，纤维素酶最适pH4.0～5.0），导致COCP 回收率逐渐降低，因此选择酶解pH 值为4.0、4.5、5.0 进行正交试验。

2.2 酶解条件正交试验结果分析

在单因素试验基础上得到了各因素的最适工艺参数，以COCP 回收率为指标，设计四因素三水平正交试验，正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 L（934）正交试验设计统计分析Table 3 Statistics of L（934）orthogonal test design

表4 正交试验方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test

由表3 和表4 可知，4 个因素对COCP 回收率均有极显著影响（p＜0.01）。4 个因素对COCP 回收率的影响顺序依次为C＞A＞D＞B。提取条件最优组合为A3B2C3D2，即在酶添加量2.5%和0.9%、酶解时间150 min、酶解pH4.5、酶解温度50 ℃的条件下，COCP 的回收率最高。通过验证试验，得到该条件下COCP 的回收率为（79.0±1.7）%，证明所优化的结果是可行的。

2.3 超声条件对COCP 回收率的影响

不同超声条件对COCP 回收率的影响见图3。

图3 超声条件对COCP 回收率的影响Fig.3 Effect of ultrasound conditions on COCP recovery rate

由图3A 可知，随着超声时间的不断延长，COCP回收率也随之增长。这是因为超声时间的延长，会使非均相体系混合更加均匀，有利于蛋白的溶出[17-19]。在超声时间为60 min 时，COCP 回收率为（80.9±1.4）%，超声时间继续延长，COCP 的回收率无显著提高（p＞0.05）。为提高生产以及节约能源，超声时间60 min 时为最佳。

由图3B 可知，回收率呈现先上升后下降趋势。在250～350 W 时，随着超声功率的增加，COCP 的回收率也随之有一定的提升，当超声功率达到350 W 时，COCP回收率达到最高值（83.3±0.6）%。这是因为超声的空化作用在介质中产生较高的剪切力，促使细胞壁破裂，有利于蛋白质的溶出[17]。当超声功率超过350 W 之后，随着功率的不断提升，COCP 的回收率随之下降，且较大的超声功率会产生更高的空化效应，产生强大的冲击波和剪切力而破坏蛋白质结构，可能会导致蛋白质功能特性的丧失[18]，为了在获得具有较好功能活性COCP 的前提下提高其回收率，因此选择超声功率350 W 为最佳条件。

当采用简单的醇溶酸沉法时，COCP 回收率仅为（54.2±1.8）%，经过酶解处理和超声处理后，回收率最高可达（83.3±0.6）%，提高了0.54 倍。

2.4 COCP 抗氧化性测定结果

自由基具有细胞毒性，能破坏细胞膜，损伤蛋白质，导致DNA 突变，修饰低密度脂蛋白，还能氧化油脂导致食品变质和营养流失[20]，对多种自由基的清除效果是判断是否具有抗氧化性的重要指标之一。COCP抗氧化性结果见图4。

图4 COCP 及维生素C 抗氧化能力比较Fig.4 Antioxidant capacity comparison of COCP and vitamin C

由图4 可知，维生素C 对羟自由基、DPPH 自由基、ABTS+自由基的清除率分别可达91.2%、95.5%、97.5%，相同浓度的COCP 的清除率分别可达66.5%、70.7%、67.9 %，相较于维生素C 的清除率略低，但仍能表明COCP 具有一定的抗氧化能力，这可能是超声处理使其中的蛋白质暴露出更多能与自由基作用的基团[21]，尤其是疏水性氨基酸，是蛋白质具有还原性的主要原因之一[22]。何玮[23]发现油茶粕蛋白富含17 种氨基酸，占比较高的谷氨酸及天冬氨酸能够提高蛋白质的抗氧化性，清除多余的自由基。

2.5 COCP 降脂能力测定结果

2.5.1 COCP 与胆酸钠的结合能力

胆酸盐是胆汁中由胆固醇衍生而来的具有甾核结构的一类两性大分子，可以通过对胆固醇和脂肪的消化吸收引起血脂水平升高。因此将胆酸盐排出体外可减少胆酸盐在肝肠循环过程中的积累，促进胆固醇的代谢，达到降血脂的目的[24]。COCP 对胆酸盐吸附率的结果见图5。

图5 COCP 对胆酸盐的吸附率Fig.5 Adsorption rate of COCP to cholate

由图5 可知，随着COCP 浓度的不断提高，对胆酸盐的吸附能力在逐步提高，在蛋白浓度为0.5 μg/mL时，对胆酸盐吸附率达到8.1%，在浓度为2.5 μg/mL时，对胆酸盐吸附率达到20.3%。这可能是COCP 中的疏水性氨基酸与胆酸盐中的疏水基团结合的原因，其中疏水性越强，与胆酸盐的结合能力就越强[25]，这说明COCP 具有一定的体外降脂能力。

2.5.2 COCP 对胰脂肪酶的抑制率

COCP 对胰脂肪酶抑制率的结果见图6。

图6 COCP 对胰脂肪酶的抑制率Fig.6 Inhibition rate of COCP on pancreatic lipase

由图6 可知，当COCP 浓度为0.50 mg/mL 时，对胰脂肪酶的抑制率较低，当COCP 浓度为1.0 mg/mL时，对胰脂肪酶的抑制率达到了（49.5±0.5）%，由此可以看出COCP 对胰脂肪酶有着一定的抑制率，且随着COCP 浓度的不断提高，对胰脂肪酶的抑制率也在不断提高。研究发现，胰脂肪酶催化活性中心并不暴露在外，而是被疏水基团组成的表面层隐藏[26]，当胰脂肪酶与底物接触时，通过电子分布的改变诱导胰脂肪酶三维结构改变，使活性中心暴露而出，与底物结合发生催化反应[27]。COCP 对胰脂肪酶抑制率具有一定的剂量依赖性。通过抑制胰脂肪酶活性，阻止脂肪被脂肪酶水解成游离脂肪酸和单酰基甘油酯，减少肠道对膳食中脂肪的吸收，从而促使脂肪从粪便中排出体外，达到降脂的效果[28]。

2.5.3 COCP 对胆固醇酯酶抑制率测定

COCP 对胆固醇酯酶抑制率结果见图7。

图7 COCP 对胆固醇酯酶的抑制率Fig.7 Inhibition rate of COCP on cholesterol esterase

由图7 可知，随着COCP 浓度的不断提高，其对胆固醇酯酶的活性抑制作用也在相应增加，当COCP 浓度为2.5 mg/mL 时，抑制率只有2.9%，当COCP 浓度达到12.5 mg/mL 时，抑制率可以达到19.5%。胆固醇酯酶作为消化酶的一种，在水解膳食性胆固醇酯和转运游离胆固醇到肠细胞方面起着重要作用[29]，整体呈酸性[30]，与蛋白之间的物理作用力有酸碱离子间作用力、羧基间的氢键作用力，COCP 对其存在一定的抑制效果，且随剂量的增加而增加，可能是因为COCP 中含有较多的酸性氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸。虽整体抑制率偏低，但依旧可以抑制胆固醇酯酶活性，减少个体对酯化胆固醇的吸收。

3 结论

本研究通过超声辅助酶解工艺提取油茶籽粕粗蛋白，并对粗提物的功能活性进行初步探究。研究发现，淀粉酶和纤维素酶添加量分别为2.5%和0.9%、酶解时间150 min、酶解pH4.5、酶解温度50 ℃，超声功率350 W，超声时间60 min 的条件下，粗提物的回收率最高，经过验证可达（83.3±0.6）%，且具有一定的功能特性，对羟自由基、DPPH 自由基和ABTS+自由基均有一定的清除效果，后续若对该粗提物进行分离纯化水解处理，能够进一步提高抗氧化能力。同时蛋白粗提物具有一定的胆酸盐吸附能力和胆固醇酶抑制效果，且具有一定的剂量依赖性，对胰脂肪酶抑制方面表现较佳，蛋白粗提物浓度为1.0 mg/mL 时，胰脂肪酶抑制率可达49.5%左右。因此油茶籽粕蛋白质作为废弃回收物，具有潜在的利用价值，后续可进一步探讨超声处理对油茶籽粕蛋白功能特性的影响，为其深加工提供理论基础。