pH 值偏移对豌豆分离蛋白冷致凝胶特性的影响

杨晨，李欣忆，梁蓝兮，刘紫韫，关自宽，秦东泽，汪建明*

（1.天津科技大学 食品科学与工程学院，天津 300457；2.优滋福（天津）食品科技有限公司，天津 300457）

水凝胶是通过物理或化学交联方法制备的具有三维网络结构的亲水聚合物，可以包埋水、风味化合物、脂质和其他成分。水凝胶在改善食品质地和口感、作为脂肪替代品以及通过3D 打印设计复杂的食物形状[1]等食品工业领域具有广阔的应用前景。根据水凝胶的形成机理一般可分为热致凝胶和冷致凝胶两大类。热致凝胶由蛋白质在高温下聚集形成网络结构，通常需要较高的蛋白质浓度并且不适于包埋热敏性物质。然而，冷致凝胶的网络结构是在室温下由可溶性热聚集体与合适的凝固剂形成，包括自由基交联[2]、转谷氨酰胺酶交联[3]、葡萄糖酸-δ-内酯酸诱导交联[4]以及盐离子交联[5]。其中，转谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG） 可以通过谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基团和赖氨酸残基的ε-氨基之间发生酰基转移反应催化形成分子间和分子内的共价键，从而在温和的条件下形成稳定的蛋白质凝胶结构[3]。目前，TG 已被广泛用于动物和植物蛋白中，以形成具有良好质地的凝胶状食品，并且更适合作为生物活性物质的递送载体[6]。葡萄糖酸-δ-内酯（glucono-δ-lactone，GDL）是一种弱酸，在水中被水解成葡萄糖酸，缓慢解离成氢离子。当体系的pH 值降低至等电点时，蛋白质分子间的静电斥力达到最小，蛋白质分子聚集形成凝胶[4]。由于GDL 凝胶形成的条件温和且易于控制，因此被广泛应用于制备蛋白质凝胶，例如大豆蛋白凝胶[7]、燕麦蛋白凝胶[8]和猪血浆蛋白凝胶[9]等。

球蛋白因其优异的性能常被用作开发水凝胶体系的良好材料[2]。而在各种蛋白质来源中，豌豆分离蛋白（pea protein isolate，PPI）与大豆蛋白、棉籽蛋白和菜籽蛋白等相比所含的毒性物质较少，且不被列为过敏原，因此豌豆分离蛋白越来越多地被用作大豆蛋白的替代品。虽然豌豆分离蛋白中球蛋白占70%～80%，但每个亚基都通过多种相互作用吸引并紧密结合，导致其具有较高的变性温度，需要在相对较高的温度下才能形成凝胶。此外，由于豌豆分离蛋白的溶解度和半胱氨酸含量都较低，导致其凝胶能力相对较弱且缺乏弹性，极大地限制了其在食品工业和生物医学领域中的应用[10]。因此，通过适当修饰来改变豌豆分离蛋白的结构以提高其胶凝能力具有重要的研究价值。

目前已经有许多研究通过物理、化学、酶预处理或组合方法来改变蛋白质分子量、空间结构、表面疏水性和静电荷等，从而改善豌豆分离蛋白的溶解性和凝胶性。Xu 等[11]通过超声改善豌豆分离蛋白的凝胶性质，所制备的凝胶样品表现出良好的咀嚼和吞咽特性；Chen 等[12]通过欧姆加热改性豌豆分离蛋白，形成的凝胶具有较好的持水性和均匀的三维网络结构。在众多改性方法中，pH 值偏移是一种简单有效的化学改性方法[13]。Zhang 等[14]通过常压冷等离子体结合pH 值偏移改善豌豆分离蛋白的凝胶特性，改性后的豌豆分离蛋白可以形成具有良好机械性能的热致凝胶。在其他研究中，花生蛋白[15]、黑豆蛋白[16]以及肌球蛋白[17]的凝胶特性均在pH 值偏移处理后得到改善。然而，目前关于pH 值偏移改性豌豆分离蛋白对TG 凝胶和GDL凝胶性质和结构的影响研究较少。

因此，为了将pH 值偏移改性豌豆分离蛋白作为添加剂更好地应用于食品工业中，本研究用pH 值偏移改性豌豆分离蛋白分别制备两种冷致凝胶（TG 凝胶和GDL 凝胶），并通过宏观特性对比两种凝胶性质的差异，再进一步通过红外光谱和微观结构阐明pH 值偏移对豌豆分离蛋白冷致凝胶结构的影响，以期为植物蛋白基凝胶体系在食品、生物医学和其他领域的应用提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豌豆分离蛋白[蛋白质含量为（90.61±1.90）%]：陕西百川康泽生物科技有限公司；转谷氨酰胺酶（酶活力100 U/g）：上海鑫泰实业有限公司；葡萄糖酸-δ-内酯：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；尿素、叔丁醇：上海麦克林生化科技有限公司；磷酸盐缓冲溶液、三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]：北京鼎国生物技术有限责任公司；甘氨酸（glycine，Gly）、考马斯亮蓝、5，5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）[5，5’-dithiobis （2-nitrobenzoic acid），DTNB]：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、NaOH、HCl、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：天津市北方天医化学试剂厂。以上化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

三温三控水浴锅（DK-8D）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；电子天平（JA200）：上海精密科学仪器有限公司；pH 计（FE28）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；磁力搅拌器（HJ-1）：金坛区西城新瑞仪器厂；真空冷冻干燥机（FD-1A-50）：北京博医康实验仪器有限公司；低温冷冻离心机（TGL-16M）：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；质构仪（TA.XT Plus）：英国Stable Micro Systems 公司；傅里叶变换红外光谱仪（NICOLET IS50）：美国Thermo Scientific 公司；扫描电子显微镜（SU1510）：日本Hitachi 公司。

1.3 方法

1.3.1 豌豆分离蛋白的pH 值偏移处理

将PPI 溶于蒸馏水中室温下磁力搅拌12 h（初始pH7.8），充分水合后使用1 mol/L NaOH 或0.5 mol/L HCl 将PPI 溶液分别调至pH7、pH10、pH11、pH12 并保持2 h，然后在室温下用0.5 mol/L HCl 或1 mol/L NaOH 缓慢滴定至pH7，同时搅拌并定容为7%（质量分数）PPI 分散体。之后将PPI 分散体置于90 ℃水浴中加热30 min 得到改性PPI 分散体，样品分别记为pH7-7、pH10-7、pH11-7、pH12-7。（注：预试验中观察到NaCl 不能使PPI 形成凝胶，因此本研究中由pH 值偏移产生的NaCl 对凝胶性质的影响可以忽略不计）。

1.3.2 豌豆分离蛋白冷致凝胶的制备

TG 凝胶：7%（质量分数）改性PPI 分散体中分别加入不同量的TG，根据预试验选择TG 添加量为30、50、70 U/g。涡旋混匀后立即转移至定制的直径为20 mm、高度为40 mm 的中空圆柱形塑料管中，45 ℃水浴1 h形成凝胶，之后将样品冰浴冷却至室温。在分析之前，凝胶样品在4 ℃下储存12 h。

GDL 凝胶：7%（质量分数）改性PPI 分散体中分别加入不同量的GDL，为了使凝胶的最终pH 值达到蛋白质等电点附近，选择GDL 添加量为8.5%、12.5%、15.0%（基于蛋白质干重的质量分数）。涡旋混匀后立即转移至定制的直径为20 mm、高度为40 mm 的中空圆柱形塑料管中，4 ℃静置12 h 制成凝胶。此时测定凝胶的最终pH 值分别为5.02、4.54、4.07。

1.3.3 质构特性的测定

采用质构仪对样品进行质构分析。将凝胶恢复至室温后切成圆柱形（直径20 mm、高度20 mm），使用P/100探头在室温下测量，设置探头测试前速度为5 mm/s、测试中以及测试后速度均为1 mm/s，触发力为5 g，压缩比为50%[18]。

1.3.4 持水性的测定

根据离心法测定凝胶的持水性（water holding capacity，WHC）。将凝胶恢复至室温后取5 g 置于50 mL离心管中，并精确记录初始质量。然后在室温下8 000 r/min 离心20 min，除去释放的水后用滤纸小心擦拭样品表面，再次称量凝胶的质量。WHC 按照公式（1）进行计算。

式中：R 为WHC，%；W1为50 mL 离心管的质量，g；W2为离心前凝胶和离心管的质量，g；W3为离心后凝胶和离心管的质量，g。

1.3.5 非网络蛋白含量的测定

参考Ge 等[19]的方法并略作修改，将1 g 凝胶切成薄片装入含有40 mL 蒸馏水的50 mL 离心管中。然后，将含有凝胶样品的离心管置于25 ℃摇床中振荡培养48 h，以使凝胶网络内外的蛋白质达到平衡状态。最后，将含有凝胶样品的离心管在4 ℃下以10 000 r/min离心10 min，并通过Bradford 法测定上清液中的蛋白质浓度。凝胶中非网络蛋白含量按照公式（2）进行计算。

式中：Rnon为非网络蛋白含量，%；Cnon为上清液中的蛋白质浓度，mg/mL；Vwater为蒸馏水的体积，mL；Cp为凝胶化前分散体的蛋白质浓度，mg/g；mgel为凝胶的质量，g。

1.3.6 游离巯基含量的测定

游离巯基的含量参考Zhang 等[14]的方法测定，并略作修改。将100 mg 凝胶置于5 mL pH8.0 的Tris-Gly缓冲液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、4 mmol/L EDTA）中，涡旋使其充分混合，然后将PPI 分散体在5 000 r/min 下离心20 min。将Ellman 试剂（Tris-Gly缓冲液配制的4 mg/mL DTNB）与上清液以1∶100 的体积比混合。然后将混合物在25 ℃下避光反应60 min，并在412 nm 处测量吸光值。使用缓冲液代替PPI 分散体作为空白对照。游离巯基含量按照公式（3）进行计算。

式中：S 为游离巯基含量，μmol/g；A412为波长412 nm处的吸光值；D 为稀释倍数；C 为蛋白质浓度，mg/mL；73.53 由106/（1.36×104） 计算得出，其中1.36×104L/（mol·cm）为摩尔消光系数。

1.3.7 二级结构的测定

将冻干的凝胶样品（1 mg）与干燥的KBr（150 mg）混合，将其研磨均匀并压成薄片。采用傅里叶变换红外光谱仪，在4 000～400 cm-1的波数范围内扫描64 次，分辨率为4 cm-1，温度25 ℃，以空气为采集背景。使用Peakfit 4.12 软件分析蛋白质二级结构的组成和含量。

1.3.8 微观结构的观察

参考Zhang 等[20]的方法，将凝胶样品切成小块（2 mm×5 mm）置于2.5%戊二醛中4 ℃固定2 h。随后使用0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.2） 将样品洗涤3次，再使用浓度分别为50%、70%、80%和90%的乙醇溶液浸泡脱水10 min。然后使用无水乙醇再次进行脱水3 次，每次浸泡10 min。最后将样品浸入无水乙醇和叔丁醇的混合物（体积比1∶1）中浸泡15 min，转移到叔丁醇中浸泡15 min。预处理后的凝胶样品真空冷冻干燥后用导电胶固定于样品台上，用离子溅射机喷洒金原子涂层并使用扫描电子显微镜在加速电压为15 kV下观察样品。

1.4 数据处理

所有试验重复3 次，数据表示为平均值±标准差。所有数据采用Origin 2018 软件绘图，并用SPSS 软件进行统计分析，P＜0.05 表示存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 pH 值偏移改性豌豆分离蛋白冷致凝胶的特性表征

2.1.1 pH 值偏移对豌豆分离蛋白冷致凝胶持水性的影响

凝胶的持水性可以反映凝胶的质地和结构稳定性，是评价凝胶性能的重要指标，并且凝胶的持水性还取决于凝胶网络的孔径和强度，以及蛋白质-蛋白质和蛋白质-水的相互作用[8]。pH 值偏移对TG 凝胶和GDL 凝胶持水性的影响见图1。

图1 pH 值偏移对TG 凝胶和GDL 凝胶持水性的影响Fig.1 Effect of pH-shifting on water holding capacity of TG gels and GDL gels

由图1（a）可知，未经pH 值偏移改性形成的TG凝胶持水性为52.0%～55.9%，而pH 值偏移显著提高了TG 凝胶的持水性（P＜0.05），并且随着pH 偏移值的增加持水性逐渐上升，pH12 偏移改性后形成的TG 凝胶对水的结合能力最强，在TG 添加量为50 U/g 时可达到（92.13±2.40）%。研究发现，在中性pH 值下由蛋清蛋白制备的凝胶持水性为90.03%[21]；基于不同制备方法的大豆蛋白凝胶的持水性为60%～95%[22]。而本研究中的较高持水性可归因于pH 值偏移对TG 交联反应产生了有益的影响，促进了凝胶网络的形成，从而有利于其束缚更多的水。随着TG 添加量的增加（30～50 U/g），TG 凝胶的持水性显著增加（P＜0.05），但是当TG 添加量大于50 U/g 时，TG 凝胶的持水性整体略微下降但差异不显著（P＞0.05），可能的原因是随着TG 添加量的增大，蛋白质-蛋白质之间的相互作用增强，当TG 过量后会削弱蛋白质-水之间的相互作用，导致持水性略微下降，在Ruzengwe 等[6]的研究中也观察到类似的结果。图1（b）显示，pH 值偏移改性对GDL 凝胶持水性的影响较小，仅在pH12 偏移改性后形成的凝胶中观察到持水性明显增大的趋势。但GDL 的添加量对凝胶的持水性有一定的影响，添加量为12.5%时凝胶的持水性相对最高，此时凝胶的最终pH 值更接近豌豆分离蛋白等电点，静电斥力达到最小值，疏水相互作用引起的蛋白质聚集会由于失去静电斥力的稳定作用而增强[13]。

2.1.2 pH 值偏移对豌豆分离蛋白冷致凝胶硬度的影响硬度是指凝胶样品在外部压力下被迫达到一定形变时所施加的力，它通常与蛋白质的凝胶结构和蛋白质组分间的相互作用力有关，可以表征凝胶网络结构的紧密程度[4]。pH 值偏移对TG 凝胶和GDL 凝胶硬度的影响见图2。

图2 pH 值偏移对TG 凝胶和GDL 凝胶硬度的影响Fig.2 Effect of pH-shifting on hardness of TG gels and GDL gels

由图2（a）可知，pH 值偏移改性后TG 凝胶的硬度随着pH 偏移值的增加而显著增加（P＜0.05），特别是TG 添加量70 U/g 时，pH12 偏移改性后形成的凝胶硬度最高（413.82 g），是对照组的3.19 倍，这与持水性的变化趋势一致。试验证明，pH 值偏移有利于TG 催化豌豆分离蛋白聚集体交联形成凝胶，凝胶强度的增加可能是因为pH 值偏移使蛋白质分子结构部分展开，聚集体粒径减小溶解度增加，使它们能够分散在水中并与TG 相互作用[23]，从而使豌豆分离蛋白在中性条件下形成更均匀、更致密的凝胶网络，导致凝胶硬度和持水性大大增强。此外，TG 的添加量也显著影响凝胶的硬度，这可能是因为pH 值偏移使豌豆分离蛋白结构展开，通过碱性处理破坏侧链相互作用，包括二硫键、疏水相互作用和最初稳定蛋白质结构的氢键，为分子相互作用创建了足够多的游离活性位点及谷氨酰胺和赖氨酸残基位点，所以随着TG 添加量的增加，形成的G-L 异肽键也增加，更利于形成蛋白质网络结构。由图2（b）可知，pH 值偏移改性后GDL 凝胶的硬度随pH 偏移值的增加呈先下降后上升趋势。随着GDL 添加量的增加，凝胶的硬度先增加后减小，这与持水性的变化趋势一致，表明pH 值偏移改性后豌豆分离蛋白变性不利于GDL 凝胶的形成。此外，过高的GDL 添加量可能导致体系过酸，pH 值低于蛋白质等电点，使得凝胶结构被破坏，性质变差。因此，pH 值偏移改性可以显著改善豌豆分离蛋白TG 凝胶的性质，而对GDL 凝胶没有显著的影响。

2.1.3 pH 值偏移对豌豆分离蛋白冷致凝胶非网络蛋白含量的影响

不参与凝胶网络形成并在凝胶化后作为可溶性组分包埋在凝胶基质中的蛋白质称为非网络蛋白质[19]。参与形成凝胶网络的蛋白数量很大程度上影响着凝胶强度及其相关特性。因此，测定凝胶中的非网络蛋白含量可以进一步了解凝胶的特性。pH 值偏移对TG凝胶和GDL 凝胶非网络蛋白含量的影响见图3。

图3 pH 值偏移对TG 凝胶和GDL 凝胶非网络蛋白含量的影响Fig.3 Effect of pH-shifting on non-network protein content of TG gels and GDL gels

如图3（a）所示，pH 值偏移改性后大大降低了TG凝胶中非网络蛋白的数量，表明有更多的蛋白质参与了凝胶网络的形成。特别是豌豆分离蛋白经过pH12 偏移改性后形成的TG 凝胶中释放的非网络蛋白比例远低于其他组凝胶。随着碱性pH 偏移值的增加，更多的蛋白质参与凝胶网络的形成，使得凝胶网络中链数增加或链增厚[24]，导致凝胶强度和持水性增加。Wu 等[25]也报道了热诱导大豆蛋白凝胶的硬度与其非网络蛋白含量呈负相关性。并且随着TG 添加量的增加，非网络蛋白含量逐渐减少，这与硬度的变化趋势一致。然而，pH 值偏移改性后形成的GDL 凝胶中非网络蛋白含量出现增加的趋势，表明pH 值偏移导致蛋白质变性，网络蛋白含量降低，不稳固的凝胶结构无法锁住水分，因此表现为持水性和硬度下降的宏观特性。在GDL 添加量为12.5%时观察到非网络蛋白含量相对较低，这与持水性和硬度的结果一致，表明在此添加量下最终pH 值最接近蛋白质的等电点，静电斥力达到最低，凝胶结构最为致密。与此同时，在GDL 凝胶中观察到释放的非网络蛋白含量远高于TG 凝胶，因为形成GDL 凝胶网络的主要作用力为非共价相互作用（离子键、氢键和疏水相互作用），而TG 催化产生蛋白质分子内和分子间的共价交联，形成的G-L 异肽键强度比疏水相互作用和氢键的强度高20 倍，并被鉴定为维持TG 凝胶网络结构的主要作用力[6]。

2.1.4 pH 值偏移对豌豆分离蛋白冷致凝胶游离巯基含量的影响

在凝胶化过程中，游离巯基会氧化形成二硫键，显著影响凝胶网络结构和机械强度[5]。pH 值偏移对TG凝胶和GDL 凝胶游离巯基含量的影响见图4。

图4 pH 值偏移对TG 凝胶和GDL 凝胶游离巯基含量的影响Fig.4 Effect of pH-shifting on -SH content of TG gels and GDL gels

如图4（a）所示，pH 值偏移改性后TG 凝胶中的游离巯基含量整体呈降低的趋势，这可能是由于凝胶化过程中蛋白质去折叠发生构象变化，部分埋藏的游离巯基被暴露导致分子内或分子间二硫键的形成[3]。另一方面，pH 值偏移可能促进了TG 催化的酰基转移反应，形成G-L 共价键，导致部分游离巯基被包裹在凝胶网络结构中而未被检测到[26]，这也导致TG 凝胶中游离巯基含量的减少。此外，pH11-7 组中随着TG 添加量的增加游离巯基含量呈降低的趋势，这是因为交联作用的增强有助于巯基二硫键的交换反应，这将促进分子间二硫键的形成。然而在GDL 凝胶中，GDL 的添加使体系pH 值下降，接近等电点时负电荷被中和，蛋白质通过二硫键和非共价相互作用发生聚集形成三维网络结构。因此，在天然豌豆分离蛋白中GDL 凝胶的游离巯基含量略低于TG 凝胶，并且在GDL 添加量为12.5%时游离巯基含量最低，此时有更多的二硫键参与凝胶网络的形成使得凝胶网络更加紧密。与此同时，pH 值偏移改性对GDL 凝胶中游离巯基含量没有显著影响，这与凝胶的持水性和硬度的结果一致。

综上所述，pH 值偏移可以作为一种有效的改性方法来改善中性pH 值下TG 交联豌豆分离蛋白凝胶的性质，但是对GDL 凝胶的性质无明显改善作用。因此，有必要进一步研究pH 值偏移对TG 凝胶结构的影响。

2.2 pH 值偏移改性豌豆分离蛋白冷致凝胶的结构表征

2.2.1 pH 值偏移对TG 凝胶二级结构的影响

对凝胶样品进行傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR） 分析以确定蛋白质分子间和分子内的键和结构。pH 值偏移对TG 凝胶红外光谱和二级结构含量的影响见图5。

图5 pH 值偏移对TG 凝胶红外光谱和二级结构含量的影响Fig.5 Effect of pH-shifting on FTIR and secondary structure content of TG gels

由图5（a）可知，凝胶样品在3 424～3 414 cm-1的峰代表酰胺A 带，这可能与游离或结合的O—H 和N—H 基团有关，2 926～2 850 cm-1的峰代表酰胺B 带，这可能与C—H 和NH2拉伸振动有关[12]；此外蛋白质中CO 的拉伸振动对应于酰胺I 带（1 700～1 600 cm-1），平面内N—H 弯曲对应于酰胺II 带（1 546～1 541 cm-1），以及N—H 弯曲和C—N 拉伸振动对应于酰胺III 带（1 386～1 240 cm-1）[27]。所有凝胶样品出现的峰的位置无显著变化，没有峰消失，也没有新的峰出现，表明pH值偏移不会完全破坏或产生新的蛋白质官能团。为了详细了解改性豌豆分离蛋白凝胶的二级结构变化，对酰胺I 带进行解卷积，以确定α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲的含量。其中，α-螺旋和β-折叠对于凝胶网络的形成至关重要[17]。由图5（b）可知，经过pH 值偏移后凝胶中α-螺旋和β-折叠含量增加，且随着pH偏移值的增加而增加，这与凝胶的持水性和质构的结果一致。Lv 等[28]研究证实大豆蛋白-马铃薯蛋白-蛋清蛋白复合凝胶中的β-折叠含量与持水性之间存在正相关性。Li 等[15]发现在花生蛋白凝胶中β-折叠含量的变化与破裂力的变化一致，并且β-转角和无规卷曲是不规则的，它们不利于有序凝胶结构的形成。在本研究中随着pH 偏移值的增加，β-转角和无规卷曲含量逐渐减少，这也证明了pH 值偏移对TG 交联反应具有促进作用，导致蛋白质交联、聚集，宏观表现为凝胶强度和持水性的提高。

2.2.2 pH 值偏移对TG 凝胶微观结构的影响

使用扫描电子显微镜观察凝胶样品的三维网络结构，从微观角度探讨pH 值偏移对TG 凝胶特性的影响见图6。

图6 pH 值偏移对TG 凝胶微观结构的影响Fig.6 Effect of pH-shifting on microstructure of TG gels

如图6 所示，未经pH 值偏移制备的凝胶样品质地柔软不具有良好的自支撑性，且具有非均匀的大颗粒聚集区域，此外未折叠的蛋白质在凝胶化过程中相互作用，再次促进聚集体粒径的增加。与此同时，蛋白质-蛋白质间的相互作用较弱导致形成的凝胶具有更松散的结构，离心后会渗出大量的水，因此表现出凝胶表面粗糙、凹凸不平的微观结构。pH 值偏移后凝胶样品表现为微观结构更加均匀、致密和光滑，并且随着pH 偏移值的增加，凝胶的微结构变得更细腻，特别是pH12 偏移改性后PPI 凝胶具有更高的交联度、更小的孔和相对均匀、光滑的表面，此时高度互连和紧密的凝胶网络表现出更强的抗外力能力，并通过毛细管效应束缚更多的水[14]，因此pH12 偏移改性凝胶的硬度和持水性远高于其他样品。Peyrano 等[29]和Chen 等[12]的研究也指出致密的微观结构与凝胶强度和持水性的提高呈正相关性。Cui 等[30]还发现交联度较高、孔隙较密的微观结构增强了大豆乳清混合蛋白凝胶的网络结构和持水性。总体而言，在本研究中TG 凝胶的二级结构和微观结构都证实了pH 值偏移可以提高豌豆分离蛋白凝胶的质构性质和持水性，并且可以调控TG诱导豌豆分离蛋白凝胶的结构和性质。

3 结论

本研究分别以TG 和GDL 作为交联剂，针对pH值偏移对豌豆分离蛋白冷致凝胶性质的影响进行了研究。结果表明，由于TG 促进了较高凝胶强度的凝胶网络形成，使得豌豆分离蛋白无论是否进行pH 值偏移处理，形成的TG 凝胶的性质均优于GDL 凝胶，但推荐TG 添加量为50 U/g，因为进一步增加TG 添加量对凝胶性质的增强没有显著影响。此外，pH 值偏移通过促进TG 的交联反应，提高凝胶的持水性和硬度，并且该凝胶显示出与大豆蛋白或动物蛋白相当的凝胶性质。FTIR 分析和微观结构也表明，pH 值偏移促进了TG 凝胶中无规卷曲和β-转角向β-折叠和α-螺旋的转化，以形成均匀致密的凝胶网络。然而GDL 凝胶的网络主要靠二硫键和非共价相互作用维持，因此pH值偏移改性对GDL 凝胶性质的改善没有显著影响。研究结果为豌豆分离蛋白作为大豆蛋白的替代品以及天然食品凝胶剂提供了理论依据。