CRISPR- Cas12a 检测牛奶中大肠杆菌方法的建立与评价

冀霞，代绍密，余若菁，黄冰冰，刘家铭，李玮玮

（1.惠州学院，广东 惠州 516007；2.惠州卫生职业技术学院，广东 惠州 516025）

牛奶可以提供人类生长发育所需的多种营养物质，同时也是很多食品的原料，但因其营养丰富的特点极易受到细菌等微生物的污染[1]。结合现如今我国牛奶制品的质量安全情况，对牛奶安全生产体系的管控和质量安全检测显得尤为重要，尤其是对牛奶制品中有害微生物检测技术的更新与升级[2-3]。当前，对牛奶等食品中大肠杆菌的检测方法包括计数检测法、免疫学法、实时荧光定量检测法、基因芯片技术等，然而这些技术都存在诸多弊端，如传统的微生物检测方法需要经过选择性培养、纯化、生化反应等步骤，存在操作复杂、检测周期长等不足[4-5]；免疫学法受自身抗体、嗜异性抗体等干扰因素影响，易出现假阳性[6-7]；实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测法和基因芯片技术等，存在试验平台要求苛刻、成本高的问题[8]。因此，迫切需要研究建立快速、精确且经济的检测牛奶中大肠杆菌的识别体系。

成簇的规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）常存在于部分细菌和大部分古细菌中，CRISPR 相关蛋白（CRISPR-associated protein，CRISPR-Cas）是用来抵御外来病毒或噬菌体基因入侵自身基因组的免疫防御系统[9-10]。当细菌抵御噬菌体等外源DNA 入侵时，在前导区的调控下，转录形成含有保守重复序列和间隔区的CRISPR RNA（crRNA），并在效应蛋白的协助下，最终识别并结合到与其互补的外源DNA 序列上，发挥剪切作用[11-12]，形成防御病毒和其它外来DNA 侵入的免疫系统。CRISPR-Cas12 和CRISPR-Cas13 是近年来被发现的新型基因编辑系统[13-15]，较之前的CRISPR-Cas9系统，有很大改进，尤其是功能性方面。Kellner 等[16]研究发现CRISPR-Cas13 可以特异性识别并直接剪切RNA，已被广泛应用于病毒检测。而CRISPR-Cas12，又称Cfd1，只能特异性识别并直接剪切DNA 双链结构[17-18]，相对CRISPR-Cas13，其更适合研发检测基因组鉴定细菌的技术。

本研究基于CRISPR-Cas12a 蛋白剪切编辑系统的原理，以大肠杆菌16S rDNA 保守区为特异性识别位点，构建CRISPR-Cas12a 识别体系，并用以检测被污染牛奶中的大肠杆菌。以期提高牛奶中大肠杆菌的检测效率，提升乳源安全水平。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本试验使用的大肠埃希菌（E. coli MG 1655、E. coli ATCC 25922、E. coli BL21、E. coli DH5α）均保存在惠州学院天然产物实验室。

LB 固体培养基、LB 液体培养基、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（lsopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA） 法蛋白质定量检测试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；氨苄青霉素（100 mg/mL）：上海麦克林生化科技有限公司；羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、Tris 缓冲溶液、DNA Marker、Ex Taq DNA 聚合酶链式反应扩增试剂盒、限制性内切酶Sac I 和BamH I：宝日医（北京）生物技术有限公司；DNA 凝胶回收试剂盒：康宁生命科学（吴江）有限公司；质粒pMBP-Cas12a：美国Addgene 公司；质粒快速提取试剂盒：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；蛋白质Marker、考马斯亮蓝染色液、十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

ABI-9700 PCR 基因扩增仪：美国Applied Biosystems 公司；ZHTY-50N 振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司；NanoDrop 2000 微量分光光度计、Sorvall Legend Micro 21R 高速冷冻离心机：美国赛默飞公司；Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统：美国Bio-Rad 公司；GHP-9050 隔水式培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；HH-1 数显恒温水浴锅：常州智博瑞仪器制造有限公司；SW-CJ-1FD 洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；QQ-150Y 超声波细胞粉碎机：上海启前电子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 表达载体构建及鉴定

根据Cas12a（Cpf1）的基因序列，设计引物Cpf1-F：CCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAAC AACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGGAA AACCTGTACTTCCAATCCAATGC；Cpf1-R：TTATTTAA TTACCTGCAGGGAATTCGGATCCTTATTAATGTTTCAC GCTGGTCTGCGCAT，并以2 μL 的pMBP-Cas12a 质粒为模版，对Cas12a 目的片段进行PCR 扩增，PCR 反应体系中，加入2.5 μL 10×PCR 缓冲液，2 μL 脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP），0.5 μL Cpf1-F 引物，0.5 μL Cpf1-R 引物，0.125 μL Ex Taq酶，用双蒸水补齐至25 μL。反应条件设置：98 ℃预变性1 min；98 ℃保持30 s，52 ℃保持30 s，72 ℃保持2 min，35 个循环；72 ℃延伸5 min，并将PCR 扩增产物进行胶纯化回收。将胶回收的Cas12a PCR 目的片段与Sac I和BamH I 酶切并胶回收的pMAL-c5x 质粒连接，将连接产物转化到DH5α 感受态细胞中，在含有100 μg/mL氨苄青霉素抗生素的LB 固体培养基上过夜培养。挑取培养基上的单菌落进行PCR 验证，并测序，获得重组质粒pMAL-c5x-Cas12a。

1.3.2 Cas12a 蛋白的表达纯化

用质粒提取试剂盒提取重组的pMAL -c5x -Cas12a 质粒，并转入E. coli（BL21）中。将转入质粒的细菌过夜培养，1∶100 的体积比转接于含有100 μg/mL 氨苄青霉素抗生素LB 液体培养基中，培养至OD600约为0.6，加入1 mmol/L 的IPTG，继续诱导4 h。PBS 重悬诱导后收集的菌体，并超声破碎（6 mm 变幅杆，52.5 W，工作3.5 s，间隙7 s）至菌液透明。10 000 r/min 离心15 min，去除细胞碎片，吸取50 μL 上清液保留，将剩余上清液在4 ℃、10 000 r/min 条件下继续离心15 min，分离上清液和沉淀，吸取上清液，沉淀加200 μL 的PBS 重悬，分离蛋白与蛋白上样缓冲液混合，100 ℃沸水浴5 min，10 000 r/min 条件下离心5 min，取20 μL 进行SDSPAGE，浓缩胶恒压80 V、分离胶电压120 V，0.1%考马斯亮蓝染色30 min，脱色液脱色至蛋白质条带清晰，并拍照分析。

使用平衡缓冲液（Tris-NaCl，pH8.0）对麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein，MBP）亲和层析柱进行平衡，利用MBP 柱亲和层析柱对带有MBP 标签的Cas12a 蛋白进行吸附纯化，用平衡缓冲液（Tris-NaCl，pH8.0） 对未结合的杂蛋白进行洗涤，用洗脱缓冲液（Tris-NaCl，pH8.0，10 mmol/L 麦芽糖） 对吸附在MBP纯化柱上的Cas12a 蛋白进行洗脱。将洗脱的蛋白放置于含有20 mmol/L Tris、300 mmol/L NaCl 的pH8.0 缓冲液中，4 ℃透析过夜。然后，用含有20 mmol/L Tris、300 mmol/L NaCl 的pH8.0 溶液平衡Superdex 200，将酶切的Cas12a 蛋白，用凝胶过滤层析柱进行纯化。取纯化的Cas12a 蛋白进行SDS-PAGE。

1.3.3 设计crRNA

根据京都基因与基因组百科全书数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），获取大肠杆菌（E. coli）K12-MG1655 的16S rDNA 序列，设计crRNA[19]。crRNA 形成茎环结构的直接重复序列为AA-UUUCUACUAAGUGUAGAU，间隔序列与靶序列互补，T 被U 取代。选取crRNA：5'- UUUGAGUUUUAACCUUGCGGCCGU -3'，进行定制合成。

1.3.4 大肠杆菌污染牛奶的制备

取大肠杆菌标准质控菌株ATCC 25922 接种于3 mL LB 液体培养基中，37 ℃，200 r/min 过夜培养，取100 μL 菌液与900 μL 牛奶混匀，为10-1稀释，依次用牛奶对大肠杆菌进行稀释，至10-9，制成不同浓度滴度的大肠杆菌污染牛奶液。取10-3、10-4、10-5、10-6、10-75个稀释度的牛奶污染样品涂布，平行3 次，37 ℃过夜培养后，对污染牛奶进行菌落统计分析，根据GB 4789.38—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数》计算各稀释梯度培养基上的菌落数，并表示为菌落形成单位CFU/mL，得到牛奶中大肠杆菌菌落总数，用GraphPad prism 进行数据分析。同时，取40 μL 各个稀释度的牛奶污染液，至2 mL LB 液体培养基，37 ℃、200 r/min 过夜培养，进行增菌。

1.3.5 PCR 扩增

将牛奶污染样品10 000 r/min 离心3 min 后，弃去上清液，加入100 μL 纯水重悬，95 ℃水浴10 min 后12 000 r/min 离心10 min，取上清液作为PCR 模板。应用合成的16S rDNA 序列通用引物27F：AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG；1492R：GGCTACCTTGTTACGACTT 进行PCR 扩增。PCR 反应体系为2.5 μL PCR 缓冲液，2 μL dNTP，0.5 μL 27F 引物，0.5 μL 1492R 引物，0.125 μL Ex Taq 酶，2 μL 模板，用双蒸水补齐至25 μL。反条件设置为98 ℃预变性1 min；94 ℃保持30 s，52 ℃保持30 s，72 ℃保持2 min，35 个循环；72 ℃延伸5 min，16 ℃保存，并将PCR 扩增产物进行胶纯化回收。

1.3.6 Cas12a 切割活性检验

根据文献[20]的方法，在酶切反应体系中，加入0.5 μL 1 mol/L N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（2-[4-（2 -hydroxyethyl）piperazin -1 -yl]ethanesulfonic acid，HEPES），3.75 μL 1 mol/L KCl，2.5 μL 100 mmol/L MgCl2，0.25 μL 10 % 甘油，1.25 μL 10 mmol/L 二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT），纯化的97 ng MG1655 16S rDNA PCR 产物，以及按照3∶4 的摩尔比分别加入不同浓度的纯化后的30 nmol/L Cas12a 和40 nmol/L crRNA；50 nmol/L Cas12a 和66.67 nmol/L crRNA；100 nmol/L Cas12a 和133.3 nmol/L crRNA，纯水补齐至25 μL，37 ℃孵育2 h 后，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析。

1.4 统计分析

每组试验平行进行3 次，数据通过GraphPad Prism 8 软件进行统计分析和绘图，两组计量数据比较采用Student's t 检验统计学分析，P＜0.05 为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 Cas12a 蛋白表达载体构建

pMAL-c5x-Cas12a 质粒构建结果验证见图1。

图1 pMAL-c5x-Cas12a 质粒构建Fig.1 pMAL-c5x-Cas12a plasmid construction

根据Cas12a（Cpf1）的基因序列，利用设计合成的上下游引物（Cpf1-F，Cpf1-R），以pMAL-c5x-Cas12a质粒中的Cas12a 序列为模版进行PCR 扩增后，得到3816 bp 大小的片段，与预测的片段大小相符（图1A）。对Cas12a 的PCR 产物进行胶回收，将胶回收的PCR产物与Sac I 和BamH I 酶切后的pMAL-c5x 质粒进行连接转化，通过100 μg/mL 氨苄青霉素抗生素的LB固体培养基筛选，随机选取8 个单菌落进行PCR 鉴定并测序分析，PCR 产物大小为3 920 bp 的单菌落为阳性，共获得5 个阳性菌落（图1B），随机选择3 个阳性菌落进行测序，所得阳性菌落均比对成功，pMAL-c5x-Cas12a 质粒构建成功。

2.2 Cas12a 蛋白表达

Cas12a 蛋白诱导少量表达结果见图2。

图2 Cas12a 蛋白诱导表达Fig.2 Cas12a protein expression

将构建成功的pMAL-c5x-Cas12a 质粒转化到BL21 感受态细胞中，加入IPTG 诱导表达，以不加IPTG 的菌液蛋白做为阴性对照，进行少量表达。蛋白SDS-PAGE 结果显示，加入IPTG 诱导后，总蛋白、上清液和沉淀样品中均出现了130 kDa 左右的条带，且比不加诱导剂组的蛋白条带明显增强，大小也与Cas12a蛋白一致，说明Cas12a 蛋白表达成功。

2.3 Cas12a 蛋白纯化

Cas12a 蛋白纯化结果见图3。

图3 Cas12a 蛋白纯化Fig.3 Cas12a protein purification

根据1.3.2 诱导表达条件，将Cas12a 蛋白进行大量表达，获得的蛋白上清通过MBP 亲和层析柱进行纯化，对纯化获得的Cas12a 蛋白进行酶切消化，最后用凝胶过滤层析的方法除去剩余的杂质蛋白。通过SDSPAGE 和考马斯亮蓝染色验证，与未经蛋白纯化的对照组相比，洗脱样中，泳道5～7 有比较明显的分子量为130 kDa 蛋白条带，且其含量和纯度较好（图3）。因此，将上述3 种回收的蛋白进行混和、分装，作为构建CRISPR-Cas12a 检测体系的Cas12a 蛋白。

2.4 Cas12a 蛋白酶切活性检验

Cas12a 蛋白酶切大肠杆菌K12 -MG1655 的16S rDNA 序列结果见图4。

图4 Cas12a 蛋白酶切大肠杆菌K12-MG1655 的16S rDNA 序列Fig.4 Cas12a protease digested 16S rDNA sequence of E. coli K12-MG1655

利用细菌16S rDNA 序列的通用引物27F、1492R，对大肠杆菌K12-MG1655 的16S rDNA 序列进行PCR扩增，核酸电泳检测结果显示，获得1 542 bp 的扩增产物（图4A）。将扩增的PCR 产物进行胶回收纯化，按30∶40 物质的量浓度加入Cas12a 纯化蛋白和crRNA进行酶切，阴性对照组用无菌水代替Cas12a。核酸电泳检测酶切结果显示（图4B），Cas12a 浓度为30 nmol/L、crRNA 浓度为40 nmol/L 时，呈现出890 bp 和1 542 bp两种条带，说明K12-MG1655 的16S rDNA 序列未完全酶切；Cas12a 浓度为50 nmol/L、crRNA 浓度为66.67 nmol/L 时，呈现出890、628 bp 和1 542 bp 3 种条带，说明K12-MG1655 的16S rDNA 序列未完全酶切，但酶切条件明显优化；Cas12a 浓度为100 nmol/L、cr－RNA 浓度为133.3 nmol/L 时，呈现出明显的890 bp 和628 bp 两种条带，且无1 542 bp 条带，说明K12-MG1655的16S rDNA 序列在此条件下完全酶切。根据酶切结果，100 nmol/L 蛋白浓度的MG1655 切割效果较好，将此条件作为构建CRISPR-Cas12a 检测体系。

2.5 CRISPR-Cas12a 检测体系检测牛奶中大肠杆菌

牛奶样品的菌落总数结果见图5。CRISPR-Cas12a体系检测牛奶中大肠杆菌结果见图6。

图5 污染大肠杆菌牛奶样品的菌落总数结果Fig.5 Total viable count of E. coli-contaminated milk samples

图6 CRISPR-Cas12a 体系检测牛奶中大肠杆菌Fig.6 Detection of E. coli in milk by CRISPR-Cas12a system

从图5 中可看出，不同浓度污染的牛奶中大肠杆菌数量存在显著性差异。将感染不同浓度大肠杆菌的牛奶样品用LB 液体培养基以1∶100 体积比稀释，过夜培养，进行增菌，收集增菌后的菌液，并用细菌16S rDNA 序列的通用引物27F、1492R 进行PCR 扩增。从图6 核酸电泳检测结果显示，不同浓度污染的牛奶均可获得1 542 bp 的扩增产物条带（图6A）。根据上述结果，采用100 nmol/L Cas12a、133.3 nmol/L crRNA浓度的CRISPR-Cas12a 检测体系对纯化的大肠杆菌ATCC25922 16S rDNA 序列的PCR 纯化产物进行酶切，不加CRISPR-Cas12a 检测体系纯化的16S rDNA序列的PCR 产物作为阴性对照，并进行核酸电泳检测。结果显示，CRISPR-Cas12a 检测体系组呈现出890 bp和628 bp 条带，没有加入检测体系的对照组DNA 片段没有被酶切（图6B），牛奶中的大肠杆菌基于CRISPRCas12a 的检测体系建立成功。

3 结论

基于CRISPR-Cas12a 的基因编辑技术，本研究成功表达、纯化了CRISPR-Cas12a 蛋白，并用纯化的CRISPR-Cas12a 蛋白、特异性的crRNA 等的混合体系，对目的基因16S DNA 准确完成靶向切割，成功构建以大肠杆菌为模型的一种细菌检测体系。牛奶作为人们日常生活中主要营养摄取源，其质量安全直接影响人们身体健康，本研究建立的CRISPR-Cas12a 系统可检测牛奶中的大肠杆菌，具有特异性强、灵敏度高、检测速度快等特点，为提高乳源中细菌的特异性检测效率奠定了基础。