猪肝中瘦肉精的TLC-SERS检测方法研究

李露露 曹萌 李文婷 王若谨 许凤

摘 要：目的：建立薄层色谱与表面增强拉曼光谱联用技术检测猪肝中3种瘦肉精的新方法。方法：先将盐酸克仑特罗、盐酸班布特罗和富马酸福莫特罗等3种对照品及处理后的猪肝样品分别用甲醇配制对照品溶液和供试品溶液，再建立薄层色谱分离系统，在254 nm下检视定位后在相应组分斑点处滴加表面增强剂银溶胶后检测其拉曼光谱，并对其进行灵敏度验证，最后对市售猪肝进行检测。结果：薄层色谱与表面增强拉曼光谱联用技术可显著增强拉曼光谱检测信號。盐酸克仑特罗、盐酸班布特罗和富马酸福莫特罗的检测限分别为1 μg、0.5 μg和0.5 μg。结论：本法灵敏度高，为苯乙胺类拟肾上腺素药物残留物的鉴别技术提供了一种快速、高效的新方法。

关键词：薄层色谱法；表面增强拉曼光谱法；瘦肉精

Abstract： Objective： To establish a new method for the detection of 3 kinds of lean meat powder in pig liver by thin-layer chromatography（TLC） and surface-enhanced Raman spectroscopy（SERS）. Method： Firstly， clenbuterol hydrochloride， bambuterol hydrochloride， formoterol fumarate and the treated pig liver samples were prepared with methanol as the reference solution and the test solution， and then a TLC separation system was established. After examining and positioning at 254 nm， the surface enhancer silver sol was added to the spots of the corresponding components to detect their Raman spectra and verify their sensitivity. Finally， the commercial pig liver was tested. Result： TLC combined with SERS could significantly enhance the detection signal of Raman spectrum. The detection limits of clenbuterol hydrochloride， bambuterol hydrochloride and formoterol fumarate were 1 μg， 0.5 μg and 0.5 μg， respectively. Conclusion： This method has high sensitivity， and provides a rapid and efficient new method for the identification of phenethylamines and adrenergic drug residues.

Keywords： thin-layer chromatography; surface-enhanced Raman spectroscopy; lean meat powder

瘦肉精是一种人工合成的β受体激动剂，学名盐酸克仑特罗，它具有苯乙胺类拟肾上腺素药物化学结构和物理化学性质，发现增加剂量可以达到重新分配动物体内营养的作用，从而提高了猪的瘦肉率，但其在猪肉中的残留也存在健康风险[1]。中国和欧盟已经禁止将它用作家畜的生长促进剂。目前特布他林、沙丁胺醇、塞曼特罗、马布林等10多种化合物统称为瘦肉精。目前，对瘦肉精的检测常用气相色谱-质谱法[2]和液相色谱-质谱法等[3]。虽然这两种方法具有精度高的优势，但要求由专门的工作人员操作，仪器设备也较昂贵等。薄层色谱法（Thin-Layer Chromatography，TLC）可以快速、高效地对微量物质进行分离，它是最简单的色谱技术之一[4]，但易出现假阳性结果。表面增强拉曼光谱法（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）具有较高的灵敏度，并可提供其表面分子的结构信息[5]，但SERS不是分离技术，因此无法使用它来区分混合物中的几种成分。猪肝中成分复杂，本研究采用TLC快速初筛，再采用SERS进一步确认，建立猪肝中的苯乙胺类拟肾上腺素药物瘦肉精的TLC-SERS检测的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

猪肝（市场随机购买10批猪肝样品，标号为S1～S10）。

盐酸克仑特罗（100072-201503，50 mg），盐酸班布特罗（101009-200701，100 mg）和富马酸福莫特罗（100633-202004，100 mg）均购自中国食品药品检定研究院；硝酸银，天津市东丽区天大化学试剂厂；柠檬酸钠，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸乙酯，天津市天力化学试剂有限公司；甲醇，天津市富宇精细化工有限公司；冰醋酸，天津市奥普升化工有限公司。

DXRxi显微拉曼成像光谱仪（激光波长780 nm），Thermo Fisher Scientific，USA；超声波清洗器，UP50南京垒君达超声电子设备有限公司；60F254铝制薄层板，德国默克公司；三用紫外灯（ZF-1S），绍兴市苏珀仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的制备

精密称取盐酸克仑特罗、盐酸班布特罗和富马酸福莫特罗3种对照品各2 mg，用甲醇溶解稀释分别配成1 mg·mL-1的对照品溶液，密闭保存备用。取少量猪肝样品，搅碎。称量10.00 g猪肝于50 mL烧杯中，分3次加入15 mL甲醇，超声15 min后，弃去滤渣，将猪肝溶液置于15 mL棕色离心管中，置离心机（4 000 r·min-1，5 min）离心沉降，取上清液，蒸发至2 mL得供试品溶液，密闭保存备用。

1.2.2 银溶胶的制备

用分析天平称取37.8 mg硝酸银溶于100 mL超纯水中，放入微波炉中加热至微沸后取出，一次性加入1%柠檬酸钠溶液2.6 mL，混匀后继续加热2 min，冷却，得到灰绿色溶胶。

1.2.3 TLC-SERS检测方法

以硅胶60F254铝制薄层板为固定相，乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸（9∶l∶2，V∶V∶V）为展开剂，分别点盐酸班布特罗对照品溶液10 μL，盐酸克仑特罗和富马酸福莫特罗对照品溶液各3 μL，采用滤纸条饱和法饱和10 min，再在室温下展开后取出，晾干，然后在254 nm的紫外灯下检视各组分斑点。在薄层中分离出的成分斑点上以及样品相同比移值（Rf）的位置原位滴加8 μL银溶胶，原位采集拉曼光谱。拉曼光谱的采集条件如下。激发光源为780 nm，采用10倍显微镜，扫描范围为300～3 500 cm-1，5.0 μm共聚焦针孔光阑，扫描方式为区域点扫，激光功率为24.0 mW，曝光时间为0.500 0 s，扫描25次。数据采集及分析软件用OMNICxi；制图软件为Origin 6.1。

2 结果與分析

2.1 TLC组分斑点的确定及对照品的SERS拉曼光谱检测

按照“1.2.3”项下TLC条件操作，得到盐酸克仑特罗、盐酸班布特罗、富马酸福莫特罗的斑点比移值（Rf）分别为0.69、0.18和0.54。分离出的成分斑点原位滴加8 μL银溶胶，按照“1.2.3”项下拉曼光谱采集条件操作，得上述3种苯乙胺类拟肾上腺素药物对照品的SERS，结果见图1。3种瘦肉精成分结构相似，但它们的SERS光谱峰形峰位不相同，可分别提供盐酸克仑特罗、盐酸班布特罗和富马酸福莫特罗指纹结构信息，可作为各组分的鉴别手段。

2.2 灵敏度考察

吸取盐酸克仑特罗对照品溶液0.5 µL、1.0 µL、2.0 µL、4.0 µL、6.0 µL和8.0 µL（相当于点样沉积量0.5 µg、1.0 µg、2.0 µg、4.0 µg、6.0 µg和8.0 µg），按“1.2.3”的方法操作，得盐酸克仑特罗的SERS图，盐酸班布特罗和富马酸福莫特罗同法操作，结果见图2。以信噪比（S/N）等于3时对应的点样量作为检测限。盐酸克仑特罗的检测限为1 μg、盐酸班布特罗和富马酸福莫特罗的检测限均为0.5 μg。

2.3 真实样品检测

取10批猪肝，按“1.2.1样品溶液的制备”方法操作得到样品溶液，再参照“1.2.3”进行操作。根据样品与对照品相同比移值处是否有斑点，初步判定1号样品可能含有盐酸克仑特罗、盐酸班布特罗；2号样品可能含有盐酸克仑特罗、盐酸班布特罗；3号样品可能含有盐酸克仑特罗；4号样品可能含有盐酸克仑特罗；5号样品可能含有盐酸克仑特罗、富马酸福莫特罗；6号样品可能含有盐酸克仑特罗；7号样品可能含有盐酸克仑特罗；8号样品可能含有盐酸克仑特罗；9号样品可能含有盐酸克仑特罗；10号样品可能含有盐酸克仑特罗。为了避免TLC出现假阳性结果，考虑利用SERS光谱法进一步确认结果，可得3种对照品和样品溶液的SERS图。根据3种对照品及相同比移值处样品的SERS图中特征峰的峰形及峰位是否相同再次进行确认。由图3可知，样品4中含有盐酸克仑特罗组分；样品8中含有盐酸班布特罗组分；样品1中含有富马酸莫特罗组分，其他样品2、3、5、6、7、9、10中未检出盐酸克仑特罗、盐酸班布特罗和富马酸福莫特罗这3种组分。由TLC和SERS结果可说明TLC法出现了假阳性结果，且SERS法的灵敏度高于TLC法，即TLC法检测不出来的组分，通过SERS法可检出。

3 结论

本文首次建立了苯乙胺类拟肾上腺素药物瘦肉精盐酸克仑特罗、盐酸班布特罗和富马酸福莫特罗3种组分的TLC与SERS联用的新的鉴别手段。在保证了TLC法检测快速、操作简便、灵敏度高的基础上，通过与SERS技术联用使其专属性较传统的TLC法有了显著提高，为苯乙胺类拟肾上腺素药物鉴别提供了一种新的思路与参考方法。

参考文献

[1]孟宏.“瘦肉精”对食品安全的影响[J].黑龙江水产，2020，39（3）：16-17.

[2]贾涛.气相色谱-串联质谱法测定饲料中的瘦肉精[J].饲料与畜牧，2013（7）：39-44.

[3]管恩平，闫涛，杨爽，等.海关食品安全快速检测标准研究进展[J].食品安全质量检测学报，2021，12（2）：447-451.

[4]邹晓伟，刘星，张建明.薄层色谱与质谱联用的研究进展[J].色谱，2023，41（1）：24-36.

[5]李志成，郑晓冬，刘雪梅，等.基于SERS技术快速检测"瘦肉精"硫酸特步他林[J].现代食品科技，2021，37（7）：321-326.