继代培养对灵芝胞外酶活力及品质的影响

周 州，宋 怡，罗 舒，姚 珂，罗 霞，许晓燕

（四川省中医药科学院，四川 成都 610041）

灵芝（Ganoderma lucidum）为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，始载于《神农本草经》，我国在20 世纪50 年代首先成功实现了野生灵芝的驯化栽培。在栽培过程中，为满足自身生长发育的需求，灵芝菌丝需将木材等基质中的纤维素、木质素、蛋白质等大分子物质分解为小分子的营养物质，从而进行吸收和转化，这一分解利用和转化过程与菌丝分泌的胞外酶活性紧密相关。

近年来，随着灵芝成为我国受众最广、市场接受度最高的食药用菌之一，灵芝栽培在我国迅速发展，年产量已达约12 万t，灵芝产业年产值超百亿元[1]。 随着灵芝产业规模化发展，继代培养在灵芝菌种保藏和扩繁中频繁使用，导致生产用灵芝菌种退化，造成灵芝减产，质量问题多发。 因此，深入研究菌种继代培养对灵芝菌丝胞外酶活力变化规律的影响，明确胞外酶活与灵芝产量和品质的相关性非常必要。

目前关于灵芝栽培技术的研究主要集中在高产菌种选育[2-5]、栽培基质筛选[6-8]、栽培技术[9]等方面，尚未见菌种继代培养对灵芝胞外酶活力及品质影响的深入研究报道。 作者通过灵芝菌种连续继代培养，研究传代次数对菌丝胞外酶活力的影响，探讨胞外酶活力与子实体产量和品质之间的相关性，为灵芝高产、高质栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

LDZX-30KBS 型立式蒸汽压力灭菌器：上海申安医疗器械厂产品；RTOP 型人工气候箱：浙江托普仪器有限公司产品；MODULYOD-230 型冷冻干燥机：赛默飞世尔科技公司产品；AL104 型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；5810R 型台式冷冻离心机：德国艾本德公司产品；2802S 型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司产品；Waters 1525 高效液相色谱仪：美国Waters 公司产品。

1.2 试剂

马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培养基：购自北京奥博鑫生物技术有限责任公司；总蛋白质定量测定试剂盒（考马斯亮蓝法）：购自南京建成生物工程研究所；2，2-二氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）和木聚糖：购自Sigma公司；齐墩果酸对照品和D-无水葡萄糖对照品：购自中国食品药品检定研究院； 灵芝酸A 对照品、灵芝酸D 对照品：灵芝酸F 对照品、灵芝烯酸A 对照品、灵芝烯酸D 对照品：均购自成都普思生物科技股份有限公司；木屑、棉籽壳、玉米芯、麦麸、石灰：购自农资市场；乙腈，色谱纯：购自安徽天地高纯溶剂有限公司；硫酸、蒽酮等：国产分析纯，购自成都科隆化学品有限公司。

1.3 供试菌株

灵芝菌株由四川省中医药科学院菌类药材系统研究与开发实验室保藏和提供。

1.4 供试培养基

1.4.1 PDA 综合培养基 PDA 培养基37 g、蛋白胨2 g、磷酸二氢钾1.5 g、硫酸镁0.5 g、蒸馏水1 L。

1.4.2 菌袋培养料 木屑质量分数20%、棉籽壳质量分数55%、玉米芯质量分数15%、麦麸质量分数9%、石灰质量分数1%，水质量分数60%~65%，pH 5~6。 棉籽壳和玉米芯预湿24 h 后，加入木屑和麦麸，混合均匀，并堆料发酵3 d，掺入石灰拌匀，选用17 cm× 33 cm×0.05 cm 的聚丙烯袋，每袋装湿料0.8 kg，121 ℃高压灭菌3 h。

1.5 方法

1.5.1 菌种继代培养 将灵芝菌种（F0）接于PDA综合培养基斜面上，置于24 ℃人工气候箱中培养至菌丝长满斜面，记为F1；继续将菌种F1接于PDA 综合培养基斜面上，培养至菌丝长满斜面，记为F2；以此类推继代接种培养，并依次编号F3、F4、…、F11、F12。

1.5.2 栽培管理 将灵芝菌种F0至F12分别接种于菌袋培养料中，置于25 ℃人工气候箱中培养，湿度65%，每代菌种接40 个菌袋。

1.5.3 菌丝胞外酶活测定

1）粗酶液制备 灵芝菌丝长满菌袋后，每代菌种各取20 个菌袋。 取上层5 cm 基质，冷冻干燥后低温粉碎过20 目筛，混合均匀后取适量基质粉末，按质量体积比1∶10 加入蒸馏水或提取液，40 ℃恒温水浴浸提2 h，8 000 r/min 离心15 min，上清液即为粗酶液[10]。

2）酶活测定 采用Bradford 法测定粗酶液中的蛋白质含量[11]；采用ABTS 法测定漆酶活力[12]，将每毫克蛋白质每分钟氧化1 μmoL 底物ABTS 所需的酶量定义为一个酶活力单位；采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定滤纸酶、纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶活力[13-16]，将每毫克蛋白质每分钟催化产生1 mg 葡萄糖所需的酶量分别定义为一个滤纸酶、纤维素酶和淀粉酶酶活力单位；每分钟催化产生1 μmol 木糖所需的酶量定义为一个木聚糖酶酶活力单位。

1.5.4 产量和质量分析

1）出芝管理及子实体采收 灵芝菌丝长满菌袋后，每代菌种各取20 个菌袋，置于27 ℃人工气候箱中出芝培养，湿度80%，光照800 lx。 子实体成熟后采收，置于50 ℃干燥箱中干燥，备用。

2）干基生物学效率测定 测定每袋灵芝子实体质量，计算干基生物学效率。

式中：W 为干基生物学效率，%；m1为每袋子实体干品质量，g；m2为每袋干培养料质量，g。

3）品质评价 观察子实体形态，测定大小；采用热浸法[17]测定子实体的浸出物质量分数；采用硫酸蒽酮法[18]测定子实体多糖质量分数；采用齐墩果酸法[17]测定子实体三萜及甾醇质量分数；参照张景丽等[19]的方法测定子实体灵芝酸质量浓度。

1.5.5 数据统计 采用SPSS 26.0 软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 继代培养对菌丝胞外酶活的影响

灵芝菌丝通过分泌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶等降解酶分解基质中的纤维素、木质素等糖类营养物质，用于满足生长代谢需要。 由图1 可知，纤维素酶、漆酶、滤纸酶和淀粉酶的活力随着灵芝菌种继代培养次数的增加而降低。 由于这些降解酶酶活力的下降，大分子营养物质的分解利用和转化能力降低，菌丝生长速度减慢，浓密度减弱，对外界环境污染的抵抗力下降。 菌丝胞外木聚糖酶的酶活力未随菌种继代培养次数的增加而变化，但整体酶活力较低。

图1 菌种继代培养对菌丝胞外酶活力的影响Fig. 1 Effects of subculture on extracellular enzyme activity of mycelium

2.2 继代培养对灵芝产量、品质的影响

如表1~3，通过干基生物学效率和成分测定可以发现，菌种继代培养次数不影响子实体三总萜及甾醇质量分数。 但随着继代培养次数的增加，灵芝干基生物学效率下降，子实体形态由大变小，出现分枝、原基不开片等现象，多糖和浸出物质量分数降低，灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝烯酸A、灵芝烯酸D 质量浓度降低。 可见，继代培养对灵芝产量和品质影响较大。

表1 菌种继代培养对灵芝形态大小与干基生物学效率的影响Table 1 Effects of subculture on morphological size and biological efficiency of G. lucidum

表2 菌种继代培养对灵芝浸出物、多糖和三萜及甾醇质量分数的影响Table 2 Effects of subculture on contents of extract，polysaccharide，triterpene and sterol of G. lucidum

表3 菌种继代培养对灵芝酸质量浓度的影响Table 3 Effect of subculture of strain on content of ganoderma acid

2.3 胞外酶活与灵芝产量和质量的相关性分析

为考察不同胞外酶活对灵芝产量和质量的影响，采用SPSS 26.0 软件对灵芝菌种继代培养过程中的5 种胞外酶酶活力与所得灵芝子实体的干基生物学效率、 浸出物质量分数、 多糖质量分数等9个指标进行Peaeson 相关性分析。结果如表4 所示，纤维素酶、漆酶、滤纸酶和淀粉酶的酶活力与灵芝子实体干基生物学效率 （产量指标） 及浸出物、多糖、灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝烯酸A 和灵芝烯酸D 质量浓度等7 个灵芝质量指标呈极显著正相关（P<0.01），与三萜及甾醇质量分数的相关性不显著（P>0.05）。 木聚糖酶酶活力与灵芝子实体质量分数指标和质量指标的相关性不显著（P>0.05）。

表4 胞外酶活与灵芝产量和质量的Peaeson 相关性分析Tabel 4 Peaeson analysis of correlation between extracellular enzyme activity and yield and quality of G. lucidum

2.4 胞外酶活与灵芝品质的通径分析

相关性分析可以解释胞外酶活与灵芝品质之间的直接关系，但对不同胞外酶之间相互作用对灵芝产量和质量的影响没有直观表现。 作者在分析胞外酶活与灵芝品质相关性基础上，采用通径分析进一步研究不同胞外酶活的相互作用对灵芝品质的效应大小。

分别以灵芝品质指标——干基生物学效率、浸出物质量分数、多糖质量分数、三萜和甾醇质量分数、灵芝酸A 质量浓度、灵芝酸D 质量浓度、灵芝酸F 质量浓度、灵芝烯酸A 质量浓度和灵芝烯酸D 质量 浓 度 为 因 变 量Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8和Y9，纤维素酶、漆酶、滤纸酶、淀粉酶和木聚糖酶酶活力为自变量X1、X2、X3、X4和X5，采用偏回归分析法建立Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8和Y9的最优多元回归方程 （剔除偏回归系数不显著的自变量），分别为Y1=2.803+0.007X2+4.159X3（F=424.148，P<0.001），Y2=3.022+0.001X2+0.010X2+1.523X4（F=156.063，P<0.001），Y3=-0.022-0.004X2+5.425X3（F=135.340，P<0.001），Y4=-0.650-5.886×10-5X1+0.010X2-2.510X5（F=3.734，P<0.1），Y5=-13.221+0.042X2+4.999X4+81.230X5（F=82.850，P<0.001），Y6=-1.665+0.015X2+0.861X4（F=89.848，P<0.001），Y7=-0.468-0.001X1+0.003X2+4.578X3（F=217.878，P<0.001），Y8=-0.164+0.001X1+0.004X2（F=102.328，P<0.001），Y9=-1.717+0.004X2+0.605X4+7.487X5（F=169.466，P<0.001），除Y4（三萜和甾醇质量分数）外，其余8 个方程的显著性检验表明具有显著差，进一步做通径分析。

由表5 可见，与干基生物学效率（Y1）的简单相关性中，自变量滤纸酶（X3）大于漆酶（X2），直径和间接通径作用X3＞X2，同时两个变量的直径和间接通径系数均为正值，说明漆酶和滤纸酶对灵芝干基生物学效率均表现为正效应，栽培基质中的漆酶和滤纸酶活力高时，将增加灵芝干基生物学效率。 决策系数是通径分析中的决策指标，用于自变量对因变量的综合作用进行排序，确定主要决策变量和限制变量[20-21]。 自变量X3对Y1的决策性大于X2，说明滤纸酶变量对Y1的综合作用是最大的，这种影响效应包括直接作用以及与其他胞外酶的协同作用。

表5 以干基生物学效率为因变量的通径分析Tabel 5 Path analysis with biological efficiency of fruiting body as dependent variable

由表6 可见，与浸出物质量分数（Y2）的简单相关性中，3 个自变量与Y2的相关性系数X1＞X4＞X2，直径通径作用的系数X4＞X1＞X2；分析各间接通径系数可知，3 个变量的间接通径系数均为正值，且X4＞X1＞X2（0.791＞0.653＞0.377），同时，X4对Y2的决策系数最高为0.895，由此可知X4对Y2的综合作用最大，说明淀粉酶对灵芝浸出物质量分数有最大影响。

表6 以浸出物质量分数为因变量的通径分析Tabel 6 Path analysis with extract content as dependent variable

由表7 可见，与多糖质量分数（Y3）的简单相关性中，2 个自变量与Y3的相关性系数X3＞X2（0.966＞0.791），直径通径作用的系数X3＞X2，其中X2与Y3的直接通径系数和间接通径系数分别为-0.436、-0.391，X2对Y3综合作用表现抑制；滤纸酶对灵芝多糖质量分数的综合影响最大。

灵芝酸类成分是灵芝的主要功效成分，其中灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝烯酸A、灵芝烯酸D 是常见的灵芝酸，常用于灵芝质量检测[22-26]。 由表8 可知，与灵芝酸A 质量浓度（Y5）的简单相关性中，3 个自变量与Y5的相关性系数X2＞X4＞X5；直接和间接通径作用的系数X4＞X2＞X5； 决策系数X4＞X2＞X5，表明X4对Y5的综合作用影响较大。 对间接通径作用 分 析 可 知，X4通 过X2、X5分 别 对Y5的 作 用 为0.494、-0.051，表明淀粉酶与漆酶的交互对提升灵芝酸A 具有正相关影响，淀粉酶通过木聚糖酶的间接作用对灵芝酸A 质量浓度有抑制作用。

由表9 可见，与灵芝酸D（Y6）的简单相关性中，自变量漆酶（X2）大于滤纸酶（X4），直接和间接通径作用均X2＞X4，同时两个变量的间接通径系数均为正值，说明漆酶和淀粉酶对灵芝酸D 质量浓度均有影响。其中漆酶对灵芝的灵芝酸D 质量浓度的综合影响最大，表明提高栽培基质中的漆酶活力，能够提升灵芝酸D 质量浓度。

表9 以灵芝酸D 质量浓度为因变量的通径分析Tabel 9 Path analysis with ganoderic acid D content as dependent variable

由表10 可见，与灵芝酸F（Y7）的简单相关性中，3 个自变量与Y7的相关性系数X3＞X2＞X1，直径通径作用的系数X3＞X2＞X1，其中X1对Y7直接通径作用和间接通径作用均为负值，这表明X1对Y7的直接通径作用和间接通径作用呈现负影响，而X2和X3对Y7的综合影响呈正向性。

表11 表明纤维素酶对灵芝烯酸A 质量浓度的综合影响最大。

表11 以灵芝烯酸A 质量浓度为因变量的通径分析Tabel 11 Path analysis with ganoderentic acid A content as dependent variable

由表12 可见，与灵芝烯酸D 质量浓度（Y9）的简单相关性中，3 个自变量与Y9的相关性系数、直接通径和间接通径作用的系数排序均为X4＞X2＞X5。其中X2对Y5的综合作用呈正相关，表明漆酶可能是影响灵芝烯酸D 的重要因素，在提高以灵芝烯酸D 为品质提升的目标中应着重把握； 间接通径作用分析可知，X4通过X2、X5分别对Y5的作用为0.405、-0.042，表明淀粉酶与漆酶的交互对提升灵芝烯酸D 具有正相关影响，淀粉酶通过木聚糖酶的间接作用对灵芝烯酸D 质量浓度有呈抑制作用，但负影响较小，同时由决策系数大小为X4＞X2＞X5可知，X4对Y5的综合作用影响较大，表明淀粉酶对提升灵芝的灵芝烯酸D 质量浓度具有重要影响。

表12 以灵芝烯酸D 质量浓度为因变量的通径分析Tabel 12 Path analysis with ganoderentic acid D content as dependent variable

3 结 语

食药用菌在菌丝生长阶段，通过分解基质内的纤维素、木质素等来合成、储存子实体发育所需的能量物质[27]，胞外酶酶活力的强弱常能反映出菌丝生理生化的活跃程度，影响食药用菌生长发育[21]。通过对灵芝菌种继代培养过程中胞外酶活力、灵芝子实体产量与质量的测定，发现菌种连续继代培养会引起漆酶、滤纸酶、纤维素酶和淀粉酶的酶活力降低，进而减少灵芝子实体产量，引起灵芝品质下降，与斑玉蕈[28]、真姬菇[29]、草菇[30]、蚕花[31]等食药用菌的研究结果相似。

为进一步研究胞外酶酶活力与灵芝子实体品质之间的关系，作者在分析漆酶、滤纸酶等胞外酶酶活力与灵芝干基生物学效率、浸出物、多糖等品质指标的相关性基础上，采用逐步线性回归法进行通径分析。 结果发现，纤维素酶、漆酶、滤纸酶和淀粉酶的酶活力与灵芝子实体产量及浸出物、 多糖、灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝烯酸A 和灵芝烯酸D 质量浓度呈极显著正相关，但与三萜及甾醇质量分数相关性不显著；通径分析进一步表明，滤纸酶是影响灵芝产量及多糖质量分数、灵芝酸F 质量浓度的关键胞外酶，纤维素酶是影响灵芝烯酸A 质量浓度的关键胞外酶。

综上所述，随着灵芝菌种继代培养次数的增加，基质中主要胞外酶酶活力降低，进而降低灵芝子实体产量和品质。 因此，在实际生产中，为获得高产、优质的灵芝子实体，应将灵芝菌种继代培养次数控制在5 代以内。 同时，鉴于滤纸酶、纤维素酶等胞外酶与灵芝品质之间的相关性，还可以通过调节栽培温度、改良基质配方等技术手段，提升滤纸酶、纤维素酶等胞外酶酶活力，以达到提产增质的目的。