泡椒凤爪溶烂腐败菌的鉴定及其致腐能力分析

尹含靓，刘 洋,2,*，谭益升，孙军华,，蒋立文,2,*，杜 秋

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；3.盐津铺子食品股份有限公司，湖南 长沙 410000）

泡椒凤爪是川渝特色风味小吃，是将湿态发酵工艺与肉制品加工技术结合的产品[1]。凤爪是鸡肉加工的副产品[2]，经过解冻、切分、漂洗、煮制、卤水泡制、调味、真空包装和辐照杀菌后制得泡椒凤爪，其口感酸鲜爽脆，含有丰富的蛋白质，脂肪含量低，是一种深受消费者喜欢的休闲制品。但由于泡椒凤爪营养丰富，有利于微生物生长繁殖，使其在贮藏及销售过程中容易出现溶烂、胀包等品质劣变的现象[3]。

为保持泡椒凤爪的脆度，产品不能高温或巴氏杀菌处理，以免胶原蛋白析出影响产品脆度和外观。传统泡椒凤爪加工中通常使用过氧化氢对原料进行预处理杀菌，但自2015年国家规定不能使用过氧化氢作为加工助剂（食药监办食监一函〔2015〕609号）后，辐照杀菌和添加复合防腐保鲜剂便成为了泡椒凤爪保质的主要方法[4-5]。然而，由于辐照剂量的限制和不同防腐剂的抑菌范围有限，导致部分腐败微生物依然可以存活，使泡椒凤爪产品出现溶烂及涨袋等腐败现象。杨琴[6]发现导致泡椒凤爪涨袋的主要产气微生物为解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和产朊假丝酵母（Candida utilis）。马含笑[7]从发软的泡椒凤爪中分离得到1 株小鳟鱼大洋芽孢杆菌（Oceanobacillus oncorhynchi）。国内外已有许多研究对肉制品中特定腐败菌的致腐能力进行探究，Liu Xiaochang等[8]通过测定腐败菌作用于鳙鱼产生的腐败代谢产物，研究了腐败希瓦氏菌、温和气单胞菌、波西米亚不动杆菌和萨拉曼卡假单胞菌的致腐能力。王筱梦等[9]通过腐败代谢产物产量因子发现Bacillussp.M1对熟制羊肉的致腐能力最强。然而泡椒凤爪中特定腐败菌致腐能力的相关研究还鲜见报道。

本研究通过高通量测序及传统培养法对溶烂泡椒凤爪中的微生物进行菌相分析及分离鉴定，将优势腐败菌接种于泡椒凤爪中判断其致腐能力，旨在为后期防控泡椒凤爪的腐败提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

泡椒凤爪样品来自湖南某食品公司，为不同生产批次的溶烂样品（YC0411、YC0507、YC0610、YC0623、YC0729、YC0811、YC0917、YC0921）及新鲜（ZC0921）样品，所有样品均按生产时间编号。

硫代巴比妥酸、三氯乙酸、无水乙醇、氯化钠、硼酸、氧化镁、盐酸（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠 天津市化学试剂研究所有限公司；1,1,3,3-四乙氧基丙烷 上海麦克林生化科技有限公司；平板计数肉汤（plate count broth，PCB）青岛海博生物技术有限公司；平板计数琼脂（plate count agar，PCA）广东环凯微生物科技有限公司；核酸定量分析试剂盒（Qubit dsDNA HS Assay Kit）美国英杰生命技术有限公司；AxyPre聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）清洁试剂盒 美国爱思进公司；RStool DNA试剂盒 美国Omega公司。

1.2 仪器与设备

ReadMax 1900全波长扫描酶标仪 上海闪谱生物科技公司；K9840型自动凯式定氮仪 海能未来技术集团股份有限公司；LDZX-50 KBS型立式高压蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂；S W-C J-1 F D 型无菌操作台苏州净化设备有限公司；SPX-250BIII型恒温培养箱天津泰斯特仪器有限公司；Centrifuge 5424型常温离心机德国Eppendorf公司；Microfuge R 22R Centrifuge冷冻离心机 上海鹏仪电子科技有限公司；A200型PCR仪 杭州朗基科学仪器有限公司；MiSeq测序仪 美国Illumina公司；Tanon EPS300型电泳仪、Tanon-2500型凝胶成像仪 上海天能公司。

1.3 方法

1.3.1 高通量测序

DNA提取：采用E.Z.N.A.Soil DNA Kit试剂盒提取泡椒凤爪样品中细菌总DNA。并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。

PCR 扩增：利用16 SrDNA V3～V4 区引物341F～805R进行扩增。PCR扩增体系总体积为25 μL，其中包含25 ng模板DNA，2×Taqmaster Mix 12.5 μL，上下游引物各2.5 μL，ddH2O补齐至25 μL。PCR扩增条件为：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32 个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR产物10 µL用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将检测合格样品送至杭州联川生物技术有限公司进行高通量测序。

数据处理：对下机数据首先根据样品的条形码（barcode）信息对数据进行拆分，再根据双端序列的重叠（overlap）关系，将序列拼接成长的tags，并将序列上建库引入的barcode和引物序列去除。使用Vsearch（V2.3.4）软件过滤掉质量值低的序列以及嵌合体序列[10]，再将具有97%以上相似性的序列分配给相同的可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）。每个OTU选择代表性序列，然后使用核糖体数据库项目（ribosomal database project，RDP）分类器将数据归类到每个代表性序列[11]。利用MAFFT（V7.310）软件对不同类群优势种群的差异进行多序列比对，研究不同OTU间的系统发育关系。以Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数和Observed OTUs为指标，用QIIME（1.8.0版）计算所有样品的各项指标并进行聚类，再通过α及β多样性分析单个样本中物种的多样性以及样本间菌群结构之间的差异[12-13]，根据每个OTU代表序列与RDP数据库和Unite数据库的比对，得到各个样本所有OTU的物种注释，对OTU进行物种分类统计后获得门水平和属水平上的物种丰度。

1.3.2 优势腐败菌分离鉴定

取泡椒凤爪样品25 g于225 mL生理盐水中，充分振荡摇匀，并进行梯度稀释。取合适稀释梯度的菌悬液100 μL涂布至PCA培养基上，放置于37 ℃培养箱中培养24～48 h，挑选平板中的不同形态典型菌落，在平板上划线2～3 次，直至得到纯化的单个菌落。挑取单菌落，进行革兰氏染色镜检观察。并对菌种进行DNA提取，使用细菌通用引物（27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行扩增测序，将所得序列在NCBI上进行序列比对。

1.3.3 优势腐败菌酶活性测定

按1%的接种量将种子液接种到液体培养基中，37 ℃、140 r/min培养48 h后，4 ℃、8000 r/min离心10 min后取上清液，即为粗酶液。

蛋白酶活性：参照GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》中的福林-酚法进行测定。

脂肪酶活性：参照GB/T 23535—2009《脂肪酶制剂》进行测定。

1.3.4 优势腐败菌致腐能力测定

1.3.4.1 菌悬液制备与接种

供试腐败菌菌株接种于PCB培养基中37 ℃培养12 h，用无菌生理盐水将其浓度调至107CFU/mL。

将泡椒凤爪样品分为6 组。4 个处理组：分别吸取0.5 mL腐败菌菌液，接种至装有10 g无菌样品的真空塑封袋中，真空包装，放置于37 ℃恒温培养箱中贮藏；对照组1：吸取0.5 mL无菌水，接种至装有10 g无菌样品的真空塑封袋中，真空包装，放置于37 ℃ 恒温培养箱中贮藏；对照组2：吸取0.5 mL无菌水，接种至装有10 g无菌样品的真空塑封袋中，真空包装，放置于-20 ℃冰箱中贮藏。在贮藏1 个月时，处理组样品均出现溶烂腐败现象，对其进行理化指标测定。

1.3.4.2 pH值测定

使用pH计（Testo 205）插入泡椒凤爪中测定其pH值。

1.3.4.3 挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值测定

参照GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》进行测定。

1.3.4.4 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值测定

参照GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的测定》进行测定。

1.4 数据处理与分析

理化指标数据为3 次平行实验的平均值，细菌群落数据分析均有4 个生物学重复，以表示。通过SPSS 26.0进行单因素方差分析（ANOVA）后进行Duncan多重比较，P＜0.05时均值差异显著。采用Origin 2021和Excel绘制数据图。使用MEGA-X软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 高通量测序法分析优势腐败菌

2.1.1α多样性分析

α多样性通常用来表示样品微生物群落组成的丰富度和多样性[14]。Observed OTUs和Chao1指数用来反映物种丰富度，而Simpson指数和Shannon指数主要反映物种多样性[15]。由表1可知，所有样品的覆盖率均达到0.99以上，说明本次测序的结果能代表样品中细菌群落组成的真实情况。新鲜样品（ZC0921）的Observed OTUs和Chao1指数比大部分异常样品高，说明溶烂样品中的细菌群落种类相较正常样品下降。同时，异常样品中的Simpson指数和Shannon指数较低，可能是优势腐败菌抑制了其他微生物的增殖。江杨阳等[16]在小龙虾腐败实验中发现，贮藏时间延长，微生物种类降低，与本研究结果相似。

表1 泡椒凤爪样品细菌α多样性比较Table 1 Comparison of bacterial α diversity of chicken feet with pickled peppers

2.1.2 细菌群落组成分析

如图1a 所示，溶烂泡椒凤爪样品（YC0411、YC0507、YC0610、YC0623、YC0729、YC0811、YC0917、YC0921）中的优势腐败菌门为厚壁菌门（Firmicutes），而正常样品（ZC0921）中的优势菌门为蓝藻菌门（Cyanobacteria）。YC0921中的厚壁菌门相对丰度在所有异常样品中最低（50.08%），其次为YC0917（85.10%），而2020年8月11日前的样品（YC0411～YC0811）厚壁菌门相对丰度均大于95%，说明随着贮藏时间延长，优势腐败菌门逐渐占据主导地位。

图1 泡椒凤爪样品细菌在门（a）及属水平（b）群落组成Fig.1 Bacterial community composition at the phylum (a) and genus (b)levels in chicken feet with pickled peppers

泡椒凤爪样品中细菌群落在属水平上的组成情况如图1b 所示。正常样品ZC 0921 中的优势菌属为Oxyphotobacteria_unclassified（71.27%），Oxyphotobacteria属于蓝藻菌门（Cyanobacteria），其广泛分布于湖泊、土壤等生态环境中[17]，因此Oxyphotobacteria_unclassified可能来源于环境中。而异常样品中的优势菌属为芽孢杆菌属（Bacillus），YC0921中不动杆菌属（Acinetobacter）、链球菌属（Streptococcus）等也具有较高的相对丰度。随着贮藏时间延长（生产时间越早），芽孢杆菌属的相对丰度增加（从34.68%增加至99.90%），而其他细菌属的相对丰度均下降，说明芽孢杆菌属为导致样品溶烂的主要腐败微生物，其抑制了其他微生物生长，使样品中的微生物种类呈降低趋势[16]。芽孢杆菌属被确定为多种肉制品中的腐败菌，如鲍鱼[18-19]和盐水鹅[20]。泡椒凤爪产生溶烂现象可能是由于芽孢杆菌具有产蛋白酶和脂肪酶活性[21]，导致泡椒凤爪中蛋白质和脂肪降解。

2.2 优势腐败菌的分离鉴定

根据高通量测序结果，对溶烂泡椒凤爪样品的潜在腐败菌进行分离纯化，共得到4 株典型菌株，其菌落形态及菌体形态如图2所示。菌株623-4表面隆起，质地黏稠；菌株811-2表面扁平有褶皱；菌株917-1表面干燥凸起，有褶皱，边缘不规则；菌株921-4表面光滑，呈放射状。4 株菌株革兰氏染色均为阳性，呈杆状，有芽孢。

图2 分离菌株的菌落形态及其菌体形态（×100）Fig.2 Colony morphology and cell morphology of the isolated strains (× 100)

根据16S rDNA建立系统发育树（表2），可知菌株623-4为甲基营养型芽孢杆菌（B.methylotrophicusL01），相似度达98%；菌株811-2为贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensisstrain 2586）,相似度达96%；菌株917-1为枯草芽孢杆菌（B.subtilisisolate BS-1），相似度达100%；菌株921-4为沙福芽孢杆菌（B.safensisstrain HNS004），相似度达98%。

表2 分离菌株的16S rDNA鉴定结果Table 2 Results of 16S rDNA identification of the isolates

2.3 优势腐败菌的酶活特性

对优势腐败菌株进行蛋白酶及脂肪酶活测定。结果显示，所有菌株均具有一定的蛋白酶及脂肪酶活性（图3）。菌株921-4蛋白酶活性最强（51.19 U/mL），其次为623-4（28.81 U/mL）、917-1（7.36 U/mL）和811-2（5.20 U/mL）。而脂肪酶活性最强的菌株为623-4（3.75 U/mL），其次为811-2（2.92 U/mL），921-4（2.83 U/mL）和917-1（2.08 U/mL）。研究表明，芽孢杆菌通常具有较高的产蛋白酶能力[22]。曹红等[23]从鱿鱼中筛选出1 株蛋白酶活性高达（257.67±2.44）U/mL的甲基营养型芽孢杆菌。沙福芽孢杆菌在优化的发酵培养基中蛋白酶活可达69.26 U/mL[24]。此外，芽孢杆菌也是重要的产脂肪酶菌株[25]，徐伟芳等[26]从土壤中筛选出的甲基营养型芽孢杆菌在最适条件下脂肪酶活性达21.22 U/mL。本研究分离得到的4 株菌可能对泡椒凤爪中的蛋白质和脂肪均具有一定的降解作用。因此，将分离菌株接种于泡椒凤爪中，进一步验证其对泡椒凤爪的致腐能力。

图3 不同菌株的蛋白酶及脂肪酶活性比较Fig.3 Comparison of protease and lipase activity of the isolates

2.4 优势腐败菌对泡椒凤爪的致腐性验证

通常，微生物代谢会产酸或产碱性物质，因此pH值是评价食品品质的一个重要指标[27]。由表3可知，接种不同腐败菌株的泡椒凤爪样品组pH值均高于C组（37 ℃贮藏空白对照），说明4 株菌均具有一定的致腐能力，其分泌的酶类物质可以降解泡椒凤爪中的蛋白质产生氨基酸、胺类等碱性物质[28-29]。

表3 接种不同腐败菌的泡椒凤爪理化指标Table 3 Physicochemical properties of chicken feet with pickled peppers inoculated with each of the spoilage bacteria

TVB-N值升高主要是由于微生物和内源酶作用于蛋白质产生氨、胺类等挥发性含氮物质[27]。4 个处理组的TVB-N值均高于同样贮藏温度下的对照C组（表3），表明4 株芽孢杆菌均对泡椒凤爪具有一定的致腐能力。郑瑞生等[18]研究发现蜡样芽孢杆菌（B.cereus）可以分解鲍鱼中的蛋白质而导致贮藏18 d TVB-N值达到362.32 mg/100 g。接种623-4菌株的泡椒凤爪TVB-N值最高（25.10 mg/100 g），接种811-2菌株的样品TVB-N值最低（12.08 mg/100 g）。尽管921-4菌株产蛋白酶能力最强，但接种921-4菌株的样品TVB-N值并不高（18.57 mg/100 g），这可能是由于921-4菌株在凤爪中生长能力较弱导致的。张若煜[30]和Wang Guangyu[31]等研究亦发现具有较强蛋白酶活性的假单胞菌在肉中生长能力较低，使TVB-N值较低，与本研究结果相似。此外，C组（6.50 mg/100 g）的TVB-N值比N组（-20 ℃贮藏空白对照）（3.13 mg/100 g）高，可能是泡椒凤爪中的内源酶降解蛋白质导致，说明低温可以抑制蛋白质的降解。

油脂中的多不饱和脂肪酸氧化分解会产生醛、酮等物质，其衍生物丙二醛（malondialdehyde，MDA）通常被用来表示脂质氧化程度[32]。TBARS值越大，说明MDA含量越高，脂质氧化程度也越高[33]。由表3可知，811-2组（0.83 mg/kg）和623-4组（0.82 mg/kg）的TBARS 值最高，而917-1 组（0.41 mg/kg）的TBARS 值比C 组（0.45 mg/kg）略低，表明菌株917-1对泡椒凤爪脂质氧化的影响较小，与体外脂肪酶活性实验（图3）结果一致。有研究表明，肉制品的品质在TBARS值大于0.6 mg/kg时会发生变化[34]，产生不愉悦的氧化风味[35]，因此菌株623-4、811-2和921-4对泡椒凤爪的品质均有一定的影响，可能导致产品脂肪降解并产生异味。C组（0.45 mg/kg）的TBARS值比N组（0.33 mg/kg）高，这可能是由于低温抑制了脂肪氧化[36]。

3 结论

本研究通过高通量测序技术与传统培养法对溶烂泡椒凤爪样品进行菌相分析及腐败菌分离，发现溶烂泡椒凤爪中的优势菌属为芽孢杆菌属，优势菌株为甲基营养型芽孢杆菌623-4、贝莱斯芽孢杆菌811-2、枯草芽孢杆菌917-1、沙福芽孢杆菌921-4。菌株921-4蛋白酶活性最强（51.19 U/mL），而菌株623-4脂肪酶活性最强（3.75 U/mL）。此外，将4 株菌分别接种于泡椒凤爪中，测定样品的pH值、TVB-N值和TBARS值判断其致腐能力。结果表明，分离得到的4 株菌均具有一定的致腐能力，其中菌株811-2对泡椒凤爪的pH值（5.48）和TBARS值（0.83 mg/kg）影响最大，菌株623-4对泡椒凤爪TVB-N值（25.10 mg/kg）影响最大。