基于生物信息学联合网络药理学探讨四神丸治疗糖尿病肾病的作用机制Δ

邓媛媛,马 钰,张 赛,李 娜,,董 奥,,李红典,,陈 澍,张勉之,3#(.北京中医药大学第二临床医学院,北京 0009; .北京中医药大学东方医院肾病科,北京 00078; 3.天津市中医药研究院附属医院肾病科,天津 3000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一[1-2]。在我国,DN是慢性肾脏病住院治疗的首要病因[3]。此外,针对DN的标准化治疗如严格控制血糖和血压等已被证明并不能有效阻止DN的进展[4]。因此,临床上迫切需要探索新的安全、有效的治疗方案。四神丸由补骨脂、肉豆蔻、吴茱萸、五味子、大枣和生姜组成,为中医经典方剂,具有补肾滋肾、健脾安中的功效,在临床上被用于治疗肠道疾病、慢性肾脏病等。网络药理学与生物信息学能够从整体角度系统把握“药物-疾病”之间多元性、多向性的作用关系[5-6]。基于此,本研究采用网络药理学联合生物信息学交互构建“四神丸-靶点-DN”的多元靶点网络,为四神丸治疗DN的疗效提供了新的多维视角,并为进一步临床精准用药提供了科学依据。

1 资料与方法

1.1 四神丸活性成分和靶点的筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)[7](https://tcmsp-e.com/)、中药分子机制的生物信息学分析数据库(BATMAN-TCM)[8](http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)检索关键词“补骨脂”“肉豆蔻”“吴茱萸”“五味子”“大枣”和“生姜”。其中TCMSP数据库筛选标准定义为:口服生物利用度(OB)>30%,类药性(DL)>0.18;BATMAN-TCM数据库筛选设置“药物-基因”间相似性得分Score cutoff≥20,AdjustedP-value<0.05。采用Swiss Target Prediction[9](http://swisstargetprediction.ch/)、STITCH[10](http://stitch.embl.de)和ChEMBL[11]数据库检索四神丸成分对应的靶点信息,通过UniProt数据库[12](https://www.uniprot.org/)将对应的蛋白名称转换成人类基因名,获取四神丸最终的作用靶点基因。

1.2 DN疾病靶点的预测

在基因疾病关联数据库(DisGeNET,https://www.disgenet.org)、人类孟德尔遗传综合数据库(OMIM,http://www.omim.org)、人类基因数据库(GeneCards)[13](https://www.genecards.org)和比较毒物基因组数据库(CTD)[14](http://ctd.mdibl.org/)中检索关键词“Diabetic nephropathy”,筛选疾病的靶基因。

在基因表达综合数据库(GEO)[15](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/)下载编号GSE30528(GPL571)、GSE1009(GPL570)、GSE96804(GPL17586)、GSE47183(GPL11680)和GSE47183(GPL14663)(OrganiSSWs: Homosapiens)的基因芯片数据原始文件。基于R语言编程“limma”软件包[16]对基因芯片数据进行分析,以|log2(foldchange)|>1 andP-value < 0.05∣作为筛选条件,默认参数设置以识别显著差异表达基因(DEGs)。对4组基因文件进行集成,并保存上调和下调的DEGs。然后,用R软件包Robust Rank Aggreg[17](https://cran.rstudio.com/bin/windows/contrib//3.5/Robur Rank Aggreg1.1.zip)对所有的DEGs进行整合和排名以进一步确定稳健DEGs。利用pheatmap包分别根据P值排序居前20位的上调和下调的DEGs进行可视化获得差异基因热图。将DEGs与DN已知的疾病靶点进行整合,得到DN的完整靶点。

1.3 四神丸治疗DN潜在靶点的获取

将筛选的成分靶点和DN疾病靶点导入Draw Venny Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制韦恩图,获得两者的交集基因,该交集靶点为四神丸治疗DN的复合靶点。用Cytoscape 3.7.2软件绘制成分-靶点关系图。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络

将复合靶点导入STRING数据库[18],Cytoscape构建PPI网络图并删除孤立节点。度值(Degree)参数表示与节点关联的边数。继续利用MCODE插件对复合靶点进行密度聚类分析,筛选网络中核心节点和簇(cluster)。cluster的筛选标准如下:Degree Cutoff≥2;Node Score Cutoff=0.2;K-core≥2;Max Depth=100。将PPI得到的核心基因与MCODE得到的得分最高的功能模块取交集,得到PPI网络中的关键基因。

1.5 富集分析

使用R软件,同时在Bioconductor在线网站(https://www.bioconductor.org/)下载org.Hs.eg.db、colorspace、stringi、DOSE、clusterProfile、pathview、ggplot2和limma等程序包,对复合靶点进行ID转换及基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析(校正P<0.05)。GO和KEGG分别选择校正P值(P<0.05)同时将结果升序排列,挑选前20个条目进行可视化。

1.6 构建成分-靶点-通路网络

采用Cytoscape构建成分-靶点-通路关系网络。

1.7 分子对接

分子对接被用来验证生物活性成分干扰DN疾病潜在靶点发生相互作用的可能性[19]。在RCSB(https://www1.rcsb.org/)下载核心基因(成分-靶点-通路网络中度值排序居前5位的核心靶标)的结构,如胰岛素基因(JUN,PDB ID:4IZY)、前列腺素内过氧化物合酶(PTGS2PDB ID:1PXX)、肿瘤坏死因子(TNF,PDB ID:7JRA)、白细胞介素1β(IL-1β,PDB ID:5R8Q)和蛋白激酶B(Akt,PDB ID:3O96)。通过Chemicalbook(https://www. chemicalbook.com)和 Pubchem(https://pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/)下载主要活性成分,包括油酸(OLEIC ACID,Pubchem ID:445639)、亚油酸(LINOLEIC ACID,Pubchem ID:5280450)、二氢依沃卡平1-甲基-2-十五烷基-4(1 h)-喹啉酮和依沃二酰胺[DIHYDROEVOCARPINE1-METHYL-2-PENTADECYL-4(1 H)-QUINOLONE和EVODI-AMIDE,Pubchem ID:5319753]、二氢吴茱萸卡品碱(DIHYDROEVOCARPINE,Pubchem ID: 5322031)、吴茱萸酰胺(EVODIAMIDE,Pubchem ID:189454)的结构(成分-靶点-通路网络中度值排序居前5位的生物活性成分)。利用Syby-X软件对蛋白质进行去水分子、去金属离子等操作,利用AutoDock软件将化合物及核心蛋白基因pdb格式转为pdbqt格式并寻找活性口袋,运行Vina进行对接。以结合能的具体数值来评估目标蛋白和活性成分的亲和力。

2 结果

2.1 四神丸中活性成分与靶点的筛选

从TCMSP、BATMAN-TCM平台,去除重复值后,得到121个符合筛选标准的四神丸的生物活性化合物。接着获取成分对应的靶点,保留唯一值后获得四神丸全部的成分靶点542个。

2.2 DN疾病靶点

通过GEO数据库下载符合筛选标准的GSE30528(GPL571)、GSE1009(GPL570)、GSE96804(GPL17586)、GSE47183(GPL11680)和GSE47183(GPL14663),用RRA包对5个数据集进行整合分析,共确定了82个稳健的DEGs,其中上调的46个,下调的36个。图1为P值排序居前20位上调和下调稳健DEGs的热图。结合GeneCards(3 236)、OMIM(67)、DisGenet(206)和CTD(241)数据库获得DN的完整的作用靶点,去除重复值后,收集到3 832个DN主要作用靶点。

绿色表示下调的稳健DEG,红色表示上调的稳健DEG;框中的值是根据DEG的log2FC值。Green indicates a downward-adjusted robust DEG, red indicates an upward-adjusted robust DEG; the value in the box is the log2FC value based on DEG.图1 前20个上调和下调稳健 DEGs的热图Fig 1 Heat maps of the first 20 robust DEGs upward and downward

2.3 复合靶点

四神丸和DN的交集靶点/复合靶点共195个,见图2。

图2 四神丸与DN交集靶点的韦恩图Fig 2 Venn diagram of the intersecting targets of Sishen Wan and DN

2.4 PPI网络的构建

将195个四神丸成分-DN相关靶点的复合靶点上传至STRING数据库。采用Cytoscape 3.7.2构建PPI网络(见图3),得到195个节点,1 271条边。PPI拓扑分析结果显示,度值排序居前10位的靶基因:胰岛素基因(INS)、蛋白激酶B1(Akt1)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素1β(IL-1β)过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARG)、原癌基因(JUN)、cAMP反应元件结合蛋白(CREB1)、前列腺素内过氧化物合酶(PTGS2)和雌激素受体1(ESR1)。利用Cytoscape 3.7.2软件中MCODE插件筛选出5个模块,确定得分最高的核心模块cluster 1,其由24个节点、176条边组成(见图3),四神丸有效成分作用的核心靶点群(包括TNF、Akt1、JUN、ESR1和PPARG等靶点)Score为15.304,集群得分代表节点和拓扑相邻节点的核心密度;得分越高代表集群越集中,表明四神丸可能通过与DN靶点的多靶点协同机制发挥作用。将度值排序居前10位的基因与cluster 1的基因取交集,得到最终的核心靶基因:PTGS2、CREB1、ESR1、TNF、IL-1β、INS、Akt1、PPARG和JUN。

A.靶蛋白的PPI网络图;B—F.PPI的聚类分析。A. PPI network map of target protein; B-F. cluster analysis of PPI.图3 PPI网络图Fig 3 PPI network diagram

2.5 富集分析

将复合靶点上传至DAVID平台,根据调整P<0.05筛选显著性条目,共得到1 578个GO条目,其中获得的生物学过程(BP)、细胞组成(CC)和分子功能(MF)条目分别为1 476、16和86条。根据调整P值将前10条GO条目进行可视化展示,见图4。由图4可知,复合靶点主要富集在积极调节脂质代谢过程、积极调节氧化还原酶活性、调节氧化还原酶活性等过程;MF主要涉及核受体活性、配体激活的转录因子活性、转录辅激活因子结合、类固醇结合和转录辅因子结合;CC表明,大多数靶点与转录调节复合物、RNA 聚合酶 II 转录调节复合物、PlaSSWa 膜外侧、核超染色质和超染色质有关。已筛选出前10条常见的KEGG途径(见图5),四神丸-DN潜在靶点涉及的信号通路包括晚期糖基化终末产物(AGE)-AGE受体(RAGE)信号通路、TNF信号通路和破骨细胞分化流体剪切应力与动脉粥样硬化等。

图4 四神丸治疗DN的GO分析Fig 4 GO analysis of Sishen Wan in the treatment of DN

图5 KEGG富集分析的双轴图Fig 5 Biaxial plot of KEGG enrichment analysis

2.6 成分-靶点-通路

在成分-靶点-通路网络中,JUN、PTGS2、TNF、IL-1β和Akt1为度值排序居前5位的核心节点,度值排序居前5位的化合物为油酸(OLEIC ACID)、亚油酸(LINOLEIC ACID)、二氢依沃卡平1-甲基-2-十五烷基-4(1 h)-喹啉酮和依沃二酰胺[DIHYDROEVOCARPINE1-METHYL-2-PENTADECYL-4(1 H)-QUINOLONE和EVODIAMIDE]、二氢吴茱萸卡品碱(DIHYDROEVOCARPINE)和吴茱萸酰胺(EVODIAMIDE),与多个节点产生联系。此外,TNF信号通路是网络中度值最高的通路,表明四神丸可能通过TNF信号通路发挥治疗作用。同时,结合图6可知,四神丸治疗DN是基于“多成分-多靶点-多途径”的交互方式实现的,而不是仅依靠单一组分或单一靶点或单一通路发挥作用。TNF通路展示见图7。

图6 成分-靶点-通路图Fig 6 Component-target-pathway diagram

红色是DN的潜在靶蛋白,绿色是TNF通路的相关靶点。Red is the potential target protein for DN, green is the relevant target of TNF pathway.图7 DN的潜在靶蛋白在TNF预测通路上调节DNFig 7 Potential target proteins for DN regulate DN in the TNF prediction pathway

2.7 分子对接

主要活性成分与关键靶点分子对接结合能见表1。结合能<0 kJ/mol表示配体分子可以自发结合受体蛋白,而结合能≤-20 kJ/mol表明配体分子具有理想的结合力,说明结合紧密,证实预测结果的可靠性。JUN、PTGS2、TNF、IL-1β和Akt1被普遍认为是DN的经典治疗靶点。由表1可见,结合对的结合能均<-20 kJ/mol,表明活性化合物对前5个靶点具有良好的结合亲和力。

表1 主要活性成分与关键靶点分子对接结合能(kJ/mol)Tab 1 Binding energy of main active component and key target molecule(kJ/mol)

3 讨论

糖尿病肾病以微量白蛋白的产生和肾功能进行性下降为特点,且损伤不可逆。四神丸始于宋代陈文中所著《陈氏小儿痘疹方论》。国医大师张大宁教授认为,肾阳亏虚,脾阳失温,先后天俱亏是DN病机变化的基本特点之一[19]。因此,四神丸治疗DN取其“补益脾肾、温阳固肾”的功效,契合DN的核心病机。此外,四神丸具有“多靶点、多功能、多靶点和多通路”的作用特点,与DN“多诱因、多病位、多路径和多机制”的致病特点相契合。基于此,本研究通过网络药理学与生物信息学深入探索了中药复方四神丸对DN的潜在分子机制。

在PPI网络中,INS、Akt1、TNF、IL-1β、PPARG、JUN、CREB1、PTGS2和ESR1被确认为四神丸治疗DN的核心靶标。Akt1隶属Akt家族,主要功能是调节细胞生长、增殖、生存和代谢。Akt1通过参与葡萄糖储存和运输过程来促进血清葡萄糖的稳态,介导胰岛素信号转导,阻止胰岛素受体去磷酸化[20]。其在糖尿病中的代谢过程中占据重要地位。此外,Akt1可激活PI3K-Akt信号通路并控制基本的细胞代谢过程,破坏足细胞,对糖尿病及其并发症具有重大影响[21]。研究结果指出,靶向治疗PI3K-Akt信号可能是未来DN治疗的重要策略[22]。TNF能够调节机体的免疫功能,介导炎症反应。在血糖高负荷状态下,TNF过度活跃,其可以介导其他炎症因子的释放,加重肾功能损伤[23-24]。上述结论进一步证实了四神丸治疗DN核心靶点的准确性。

本研究采用GO富集分析法探索整体蛋白质的分布,把握整体蛋白质与生物学功能的相关性。结果表明,常见的蛋白质靶标具有多种生物学功能,包括核受体活性、配体激活的转录因子活性的分子功能。KEGG途径富集分析晚期糖基化终末产物(AGE)-AGE受体(RAGE)信号通路、TNF信号通路等能够确定关键蛋白质参与的重要生化代谢途径和信号转导途径。AGE-RAGE信号通路为四神丸调控DN治疗效果的主要途径。在病理学层面,先天免疫、慢性炎症和氧化应激是DN发生、发展的主要机制[25]。AGE-RAGE信号通路的激活可能加重DN中的氧化应激和慢性炎症[26]。此外,RAG过度活跃,可导致多条信号通路的激活,如PI3K-Akt、MAPK-ERK和NF-κB[27]。靶向治疗AGE-RAGE通路已被证明可以明显改善DN的进展[28]。这些关键蛋白、生物学功能和信号通路共同揭示了四神丸对DN的治疗机制。

在成分-靶点-通路网络中,油酸、亚油酸、二氢依沃卡平1-甲基-2-十五烷基-4(1 h)-喹啉酮和依沃二酰胺、二氢吴茱萸卡品碱、吴茱萸酰胺被确定为与大多数潜在靶点相关的主要的生物活性成分。分子对接结果也验证了上述成分与大多数靶基因具有稳定的结合特性,它们被认为是四神丸治疗DN的关键成分。且临床研究结果显示,四神丸治疗慢性肾脏病的临床疗效显著,能够明显改善患者肾性血尿症状[28]。油酸来源于自然界,以甘油酯的形式存在于动植物油脂中。据报道,油酸对软化血管有一定效用。有研究指出,硝基油酸和氯沙坦通过抑制db/db小鼠肾脏NADPH氧化酶系统,抑制氧化应激,从而发挥保护肾脏的作用[29]。文献报道,亚油酸能够降低血液胆固醇水平,预防动脉粥样硬化。有研究结果表明,高亚油酸饮食被认为是减轻糖尿病并发症的重要饮食结构[30];研究结果显示,亚油酸饮食可降低DN模型的血浆脂质,并通过血小板和肾皮层抑制类二十烷酸的合成,改善DN模型[31]。总之,四神丸是一种具有多靶点治疗作用的中药复方。应对上述活性化合物与DN之间的联系进行更深入的研究。

本研究中,油酸、亚油酸、二氢吴茱萸卡品碱、吴茱萸酰胺等被确定为四神丸的主要活性成分,JUN、PTGS2、TNF、IL-1β和Akt1为核心靶标;分子对接结果表明,四神丸的主要活性成分与核心靶标表现出良好的结合作用;AGE-RAGE信号通路是治疗DN的关键通路。本研究揭示了四神丸对DN的潜在药理作用机制,可为临床应用提供参考。