金属盐强化乙醇预处理和添加剂联合对杨木酶解的影响

朱光辉，黄心宇，毛翠平，谢君，张红丹※

（1. 华南农业大学生物质工程研究院，广州 510642；2. 山东天成工程咨询有限公司，潍坊 261100）

0 引言

能源危机、环境污染和温室效应使得人们迫切地需要寻找一种可以替代石化能源的可再生资源。生物质能源由植物体通过光合作用所得到，其储量巨大、来源方便、可再生，可以直接转化为化学品和液体燃料，其中，木质纤维素是生物质能源最主要的存在形式，通过生化转化的手段将木质纤维素转变成可发酵糖，并进一步转化为燃料乙醇和化学品是生物炼制的重要途径之一，从而受到了各国广泛的关注和研究[1]。杨木作为一种速生丰产树种，是一种极具潜力的生物质能源，它主要由纤维素、半纤维素和木素组成，它们相互连接，形成一种致密的抗降解屏障，这种结构将影响纤维素酶对杨木的可及性，从而影响酶解效率，进而增加纤维素乙醇的生产成本，因此预处理是将林木生物质转化为燃料乙醇的最重要一步[2]。

有机溶剂预处理是指采用有机溶剂或其水溶液在100～250 ℃下去除木质纤维原料中的木素和/或半纤维素[3]，有机溶剂乙醇因其可回收、低毒和低成本的优点而被广泛应用于预处理过程中，然而仅靠半纤维素中乙酰基的脱落所形成的乙酸来催化乙醇预处理以降解木素和半纤维素是不够的，因此需要在预处理过程中添加酸性催化剂以提高其酶解效率[4]。金属盐预处理因能实现木质纤维素组分的有效分离，达到传统酸预处理效果的同时还可规避对设备腐蚀等缺点[5-6]，正逐渐替代传统无机酸作为催化剂用于生物质原料的预处理。其作为催化剂进行预处理能有效水解半纤维素组分，原因在于酸性金属盐溶于水后生成的水合氢离子能有效破坏木质纤维素的紧密结构，并产生更易被酶水解的固体残留物[7]，此外，路易斯酸中某些特定的离子对酶活性有积极影响[8]。

有机溶剂预处理和金属盐预处理的联用(即金属盐强化的有机溶剂预处理)能够在大量地去除木质素和半纤维素的情况下，保持较高的催化效率。ZHANG等[9]通过对比未处理的和分别经过FeCl3、CuCl2、AlCl3强化乙醇预处理后的巴沙木的酶解效率，发现预处理后样品的糖得率在81.54%～85.81%，远高于未处理的巴沙木直接酶解的葡萄糖得率9.98%。HAN等[10]在CuCl2强化的乙醇预处理后杨木酶解过程中进行茶皂素的添加，葡萄糖和木糖得率分别达到97.96%和87.1%。综合以上研究报道，虽然对金属盐强化有机溶剂预处理和表面添加剂联用能够促进木质纤维素的酶解效率，但对不同金属盐强化有机溶剂预处理与不同种类添加剂联用的作用效果及其机制不清楚。

本研究旨在探究不同金属盐强化乙醇预处理对杨木化学组成、预处理液糖成分、微观物理结构和酶解葡萄糖产率的影响，分析酶解阶段不同种类阶添加剂(吐温80、茶皂素、BSA、木聚糖酶)的添加对杨木酶解葡萄糖得率和增长率的影响，以期为进一步揭示金属盐强化乙醇预处理联合添加剂对杨木酶解促进效果的影响机理提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究中使用的杨木约0.5～0.1 mm，意大利杨，生长于河南，由华南农业大学木材加工厂提供，在室温下用密封袋保存。杨木原料的化学成分含量根据美国国家可再生能源实验室提出的方法进行测定[11]，其中纤维素的质量分数为45.56%、半纤维素的质量分数为14.98%、酸不溶木素的质量分数为22.86%、酸溶木素的质量分数为3.31%。

无水乙醇（分析纯），购于中国国药集团化学试剂有限公司。吐温80(化学纯)，购于科密欧化学试剂有限公司。牛血清白蛋白（化学纯），购于伯奥生物科技有限公司。茶皂素（纯度≥95%）和木聚糖酶（100 000 U/mg），皆购于上海麦克林生化科技有限公司。赛力二代纤维素酶，购于诺维信中国生物技术公司，采用DNS 方法测得其滤纸酶活为138 FPU/mL，于4 ℃冰箱中保存。FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2、CaCl2、NaCl、LiCl、乙酸和乙酸钠等化学药品，皆为分析纯，购于上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 金属盐强化乙醇预处理

准确称量15 g 绝干杨木于300 mL 的高压反应釜（Parr-4500,美国Parr 公司）中，加入150 mL 60%（体积比）的乙醇溶液，使其固液比为1:10，加入相当于0.025 mol/L 的金属盐（FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2、CaCl2、NaCl 和LiCl），充分搅拌均匀后，盖紧密封盖，套上加热套，设置转速为300 r/min，在200 ℃下持续反应10 min[12]。当试验温度达到预定温度时开始计时，反应结束后立即停止加热，拆下加热套，用流动水将其冷却至室温，然后进行真空抽滤分离预处理液体和残渣，收集部分预处理液以测预处理液中的单糖和低聚糖。收集剩下的预处理残渣，用自来水和去离子水充分洗涤至中性后，装入密封袋，放入4 ℃冰箱中平衡水分，然后称取少量预处理样品进行水分含量测定，计算预处理后杨木的固体残留率。

1.3 预处理样品的酶解

准确称取相当于2 g 不同金属盐强化乙醇预处理绝干样品，分别加入含有100 mL pH 值为4.8 的乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.05 mol/L）的150 mL 锥形瓶中，其固液比为2%，加入15 FPU/g 干物质的纤维素酶，混合均匀后放于50 ℃、150 r/min 的摇床中进行酶解，并在酶解时间为6、12、24、48 和72 h 时，分别取0.5 mL 上清液，沸水浴10 min 使其中的纤维素酶灭活，然后测量酶解液中的葡萄糖含量。

1.4 添加剂添加试验

根据我们前期实验结果，选取吐温80、茶皂素、BSA 和木聚糖酶等4 种添加剂分别按照30、40、40、0.8 mg/g 底物进行添加，探究不同种类添加剂对酶解效率的影响[10]。

1.5 分析方法

1.5.1 组分分析

预处理液及酶解液中的葡萄糖、木糖含量通过高效液相色谱仪HPLC（UV-2 600,岛津（香港）有限公司）测定，所用色谱柱为KS801 柱，配有示差折光检测器。检测条件为：流动相为经过脱气处理的去离子水，流速为0.4 mL/min，柱温为60 ℃；进样量为10 μL，检测运行时间为30 min[10]。

预处理液及酶解液中的葡聚糖、木聚糖含量的测定，需要先将低聚糖降解为单糖，再通过单糖的增加量计算。具体操作步骤为：取2 mL 预处理液于玻璃耐压瓶中，加入10 mL 4%的稀硫酸，摇匀后置于高压灭菌锅中，在121 ℃下反应1 h，反应完成后，待高压灭菌锅内温度降至室温，将中和后液体通过HPLC 测量其中的总葡萄糖和总木糖含量。

1.5.2 扫描电镜(SEM)分析

采用EVO18 扫描电镜（Carl Zeiss AG,Germany）对杨木原料以及预处理样品的微观物理形态变化进行分析。取少量杨木原料以及预处理后的样品，充分烘干后研磨粉碎，均匀地洒落在贴有导电双面胶的样品台上，用吸耳球吹去未被粘牢的样品颗粒，在真空环境下进行镀金处理，在物料表面蒸镀一层导电层后，进行扫描电镜分析，摄像记录，加速电压为10 kV。

1.5.3 X-射线衍射（XRD）分析

杨木原料和预处理样品的结晶度指数（XCrI）是用Bruker D8 AdvanceX 射线衍射仪（Bruker Corporation,Germany）测定的。采用Al 靶产生的X 射线（Ka=0.154 nm），用Ni 滤波片滤掉特定波长的光。衍射角（2θ）的扫描范围为5°～80°，扫描速度为2°/min，扫描电压30 kV，扫描电流30 mA。结晶度指数(XCrI)由衍射图谱上结晶峰的强度与总强度（I002）的高度比确定[13]，如式（1）：

式中I002是22.5°左右的主峰的衍射强度，Iam是18°左右的无定形区域的衍射强度。

1.5.4 数据处理方法

酶解过程中葡萄糖得率及葡萄糖增长率的计算方式分别如式（2）和式（3）所示。

2 结果与分析

2.1 不同金属盐强化的乙醇预处理对杨木的影响

本研究探讨了不同金属盐强化的乙醇预处理对杨木原料的影响，预处理后的固体回收率和化学组成分析如表1 所示。由表可知，杨木原料中葡聚糖、木聚糖、酸不溶性木质素（acid insoluble lignin,AIL）和酸溶性木质素（acid soluble lignin,ASL）的含量分别为45.56%、14.98%、22.86%和3.31%。经预处理后，样品中半纤维素和木素的质量分数显著降低，这是因为金属盐强化乙醇破坏木素和半纤维素中的酯键、醚健以及糖苷键所致[14]；由于木素和半纤维素的去除，使得预处理后杨木中纤维素含量迅速增加。对于FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2和MnCl2等过渡金属盐强化的乙醇预处理样品来说，半纤维素和木素的质量分数仅为2.27%～9.18%和5.49%～11.06%，而纤维素的质量分数增至70%左右，这说明半纤维素和木素的去除不仅能够打破由纤维素、半纤维素和木素所形成的致密结构，而且纤维素含量的增加为后续纤维素酶的酶解提供更多地可接触位点。对于碱土金属盐（MgCl2和CaCl2）和碱金属盐(NaCl 和LiCl)强化乙醇预处理样品来说，半纤维素和木素的降解有限，从而得到较高的固体回收率，且纤维素的含量仅有些许升高。

表1 不同金属盐强化乙醇预处理对固体回收率及杨木组分的影响Table 1 Effect of metal-salts catalyzed ethanol pretreatment on solid recovery and chemical compositions of poplar %

由表1 可知，在金属盐强化的乙醇预处理过程中会发生半纤维素和木素的去除以及部分纤维素的降解，因此我们对预处理液中单糖和聚糖含量进行测定，结果如表2 所示。由表可知，预处理液中的总葡萄糖质量分数非常少（＜1.08 g/100 g 原料），且大部分是以低聚葡萄糖的形式存在，这说明金属盐强化的乙醇预处理可以保留杨木中大部分纤维素。对于金属盐强化的乙醇预处理来说，半纤维素降解产物总木糖的质量分数在2.20 g/100 g原料以上，最高可达4.83 g/100 g 原料，且大部分以低聚木糖的形式存在。由此可见，金属盐强化的乙醇预处理液中释放的木糖比葡萄糖多，这是因为相对于结晶态纤维素来说，无定形态的半纤维素更容易降解[15-16]，且金属盐强化的乙醇预处理更有利于低聚木糖的回收，从而提升其利用价值。

表2 不同金属盐强化乙醇预处理液中糖的含量Table 2 Sugar content in metal-salts catalyzed ethanol pretreatment liquor g·(100 g)-1

2.2 预处理后样品表征

为对比不同价态金属盐强化乙醇预处理杨木表面形貌和结晶度的影响，分别对三价态金属盐（FeCl3和CrCl3）、二价态过渡金属代表（FeCl2）和碱土金属代表（MgCl2）以及一价态金属盐（NaCl 和LiCl）进行表征分析。

2.2.1 扫描电镜分析

对预处理前后杨木表面形貌放大2 000 倍后进行扫描电镜分析，结果如图1 所示。与预处理后样品相比，未经处理的杨木表面完整光滑，纤维束排列整齐，这样致密结构阻碍了纤维素酶对纤维素的进攻，不利于后续的酶水解。按照金属盐价态进行对比，可以发现一价态金属盐如NaCl 和LiCl 处理后的杨木表面仍然保持较为光滑的表面，出现少许裂纹。二价态金属盐如FeCl2和MgCl2处理后的杨木表面裂纹明显增多并出现少量孔洞。而三价态金属盐如FeCl3和CrCl3处理后的杨木表面裂纹多，有较多的孔洞，表面粗糙。

图1 杨木原料和不同金属盐强化乙醇预处理后样品的SEM 图像Fig.1 SEM images of raw and metal-salts catalyzed ethanol pretreated poplar

因此，可以得出不同金属盐强化的乙醇预处理后，杨木基质表面出现了裂纹和孔洞，变得松散、无序，使纤维暴露程度增大，结合表1 中不同预处理后杨木组分剩余的木质素和半纤维素，可以得出这是由于金属盐强化乙醇预处理过程中半纤维素和木素的去除，使原本的致密结构遭到破坏，为纤维素酶提供更多的活性位点，提高酶对纤维素的可及性，从而提高其酶解效率[17-18]。

2.2.2 不同预处理杨木结晶度分析

纤维原料的结晶度是影响酶解效率的一个重要影响因素。许多研究表明由于预处理能去除部分半纤维素或木素，进而改变纤维原料的结晶度，为此我们对杨木原料和不同金属盐强化乙醇预处理后样品进行了X 射线衍射分析，并根据Segal 公式计算得出其相对结晶度。杨木原料的结晶度（CrI）为64.14%，经FeCl3、CrCl3、FeCl2、MgCl2、NaCl 和LiCl 强化的乙醇预处理后其CrI分别上升至78.63%、78.65%、78.92%、77.26%、75.79%和70.33%。我们推测这是因为在金属盐强化的乙醇预处理过程中，由于无定形态半纤维素和木素的脱除，使得预处理样品中结晶态纤维素相对含量增加，导致了预处理样相对结晶度增加[19]。为此，我们将结晶度与金属盐强化乙醇预处理过程中半纤维素和木素去除率进行相关性分析，结果如图2 所示。由图可知，金属盐强化乙醇预处理后样品的结晶度与半纤维素和木素去除率均具有较强相关性，R2分别为0.801 3 和0.893 9，这说明随着金属盐强化乙醇预处理中半纤维素或木素脱除的增加，预处理后样品的结晶度逐渐增加。尽管金属盐强化乙醇预处理样品的结晶度比杨木原料高，但是其酶解效率较杨木原料有很大提升，这是由于预处理过程中无定形态半纤维素和木素的去除使得更多的纤维素暴露在表面，有利于酶的进攻，进而提高了酶解效率；同时由于预处理后样品中木素含量的降低，减少了木素对纤维素酶的无效吸附，为纤维素提供更多的游离酶，从而提升酶解效率[20]。

图2 结晶度与木质素去除率和半纤维素去除率拟合Fig.2 Fitting of XCrI with the removal rate of hemicellulose and lignin.

2.3 不同金属氯化物强化的乙醇预处理后杨木酶解的影响

为进一步评价预处理效果，我们对金属盐强化的乙醇预处理后样品进行酶解，酶解葡萄糖得率如图3 所示。由图可知，对杨木原料直接进行酶解，24 h 后的葡萄糖得率为11.3%，当酶解时间延长到72 h 时，原料的葡萄糖得率降至9.9%。与杨木原料直接进行酶解相比，金属盐强化的乙醇预处理样品的酶解效率有明显提升，这主要是因为通过金属盐如FeCl3不仅可以去除杨木中木质素和碳水化合物之间的醚键和一部分的酯键，降低聚合度而且可以去除杨木中的半纤维素，从而暴露了结晶纤维素核心，增强酶解效果[21]。乙醇预处理同样也可以去除木质素和碳水化合物之间的醚键，促进木质素分解成木质素碎片的能力，而乙醇脱木质素的动力学受到溶剂对木质素碎片的溶解能力的影响[22]，通过金属盐强化乙醇处理有助于木质素碎片溶解能力的提高，从而在去除半纤维素的同时提高对木质素的移除能力，从而极大的提高酶解效率。

图3 不同金属氯化物强化乙醇预处理对杨木酶解产葡萄糖得率Fig.3 Effect of different metal-salts catalyzed ethanol pretreatment on the glucose yield from poplar

可以发现，不同种类金属盐对酶解效率的提升作用不同。对于三价金属盐FeCl3和CrCl3强化的乙醇预处理杨木来说，酶解72 h 的葡萄糖得率分别为89.08%和75.06%。对于二价金属盐强化的乙醇预处理杨木来说，酶解72 h 的葡萄糖得率分别为72.51%（CuCl2）、86.45%（FeCl2）、66.96%（ZnCl2）、74.67%（MnCl2）、62.60%（MgCl2）和47.35%（CaCl2）。对于一价金属盐NaCl和LiCl 强化的乙醇预处理杨木来说，其酶解效率明显低于三价和二价金属盐强化的乙醇预处理后杨木，仅为30.51%和32.58%。由以上分析可知，不难发现在不同金属盐强化的乙醇预处理对酶解葡萄糖收率的作用由大到小依次为：三价金属氯化物、二价金属氯化物、一价金属氯化物[23]。

根据不同阳离子相对应的元素在元素周期表中的分布，这些金属氯化物可分为：过渡金属氯化物（FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2和MnCl2）、碱土金属氯化物（MgCl2和CaCl2）和碱金属氯化物（NaCl 和LiCl）。在这些金属盐中，过渡金属氯化物（FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2和MnCl2）的加入显著提升了乙醇预处理样品的葡萄糖收率，这是因为金属盐阳离子具有路易斯酸的特性，有助于糖苷键的断裂，脱除较多的半纤维素，破坏其致密结构，从而提升其酶解效率，但是由于不同金属盐接受电子的能力以及金属离子间的离子半径不同，使得不同其酸性不同，从而呈现不同的酶解效率[24-25]。碱土金属阳离子（Mg2+和Ca2+）的电子受体能力弱于过渡金属阳离子。与过渡金属和碱土金属阳离子相比，碱金属阳离子（Na+和Li+）在接受电子方面表现最弱，对生物质原料中的酯键和糖苷键的断裂最少，无法提高糖的回收率[26]。此外，根据前人的研究结果表明，Cl-离子的浓度高低也会影响木聚糖和纤维素的分解[27]。因此，乙醇预处理过程中三价金属氯化物FeCl3和CrCl3的添加对预处理底物酶解产生了强烈的影响，促使酶解效率大大提升。而FeCl2添加的影响优于CrCl3的影响，可能是因为：1）杨木经过CrCl3强化乙醇预处理后，其中的大部分半纤维素和木质素被去除，原本的纤维结构发生坍塌，纤维素与酶的可接触面积减少，导致CrCl3强化乙醇预处理的酶解糖产率小于FeCl2；2）铬作为重金属元素会使纤维素酶变性和失活，导致Cr3+预处理杨木样品酶解的效率变差。

2.4 添加剂对预处理后杨木样品酶解的影响

2.4.1 吐温80 的添加对预处理后杨木酶解效果的影响

由以上分析可知，杨木原料经过不同氯化物强化乙醇预处理后的酶解效果存在差异，为进一步提升其酶解效率，拟在酶解段进行添加剂（吐温80、茶皂素、BSA、木聚糖酶）的加入以提升其酶解效率。

吐温80（30 mg/g 底物）的加入对不同金属盐强化的乙醇预处理样品酶解葡萄糖得率及其葡萄糖增长率的影响如图4 所示。吐温80 是一种非离子添加剂，酶解段吐温80 的添加可以提高底物对纤维素分解酶的吸附/脱附能力，减少酶的非生产性结合和无效吸附，使纤维素酶可以降解更多的纤维素[28-29]。由图可知，吐温80 的加入对葡萄糖得率具有明显提升作用，其中经FeCl3强化的乙醇预处理后样品的葡萄糖的得率达到最大，酶解48 h 后，其葡萄糖得率为91.18%，高于未添加添加剂下酶解72 h 的葡萄糖得率（89.08%），继续增加其酶解时间至72 h，可得最高葡萄糖得率为93.44%，此时其葡萄糖增长率随着时间的延长从40.59%（6 h）逐渐降低至4.90%（72 h）。

图4 吐温80 的添加对不同金属盐强化乙醇预处理后杨木葡萄糖得率和葡萄糖增长率的影响Fig.4 Effects of tween 80 on glucose yield and increased glucose yield of poplar after different metal-salts catalyzed ethanol pretreatment

对于金属盐强化的乙醇预处理后样品来说，其酶解过程中葡萄糖的增长率均呈现先增加后降低的趋势，增长最明显的是NaCl 强化的乙醇预处理，在酶解24 h 时，其最大增长率可达88.68%，尽管酶解72 h 后其葡萄糖增长率仍保持在76.53%，但是其葡萄糖得率仅为53.85%，这主要是归因于NaCl 强化的乙醇预处理并未彻底地破坏杨木原料的致密结构，从而阻碍纤维素酶对纤维素的进攻，同时未被脱除的木素的在未添加吐温80 的情况下对纤维素酶具有无效吸附作用，进而影响其酶解效率，而随着吐温80 的加入，未被脱除的木素与纤维素酶的结合减少，使得更多的纤维素酶吸附于纤维素表面，从而大幅提升其酶解效率[30]。除了NaCl 外，CaCl2、LiCl、ZnCl2、MnCl2强化的乙醇预处理后杨木在吐温80 的作用下均表现出优异的葡萄糖增长率（20.65%～51.12%，72 h），但是仅ZnCl2和MnCl2强化的乙醇预处理后样品的葡萄糖得率增长至90.09%以上，这主要是由于添加添加剂吐温80 时CaCl2和LiCl 强化的乙醇预处理后样品较低的葡萄糖得率32.58%～47.35%。与此同时，对于FeCl2和MgCl2强化的乙醇预处理后样品来说，尽管在酶解前期吐温80 的加入能大幅提升其酶解效率，但酶解达72 h 时其葡萄糖得率没有增加。

2.4.2 茶皂素的添加对预处理后杨木酶解效果的影响

图5 所示为茶皂素的添加(40 mg/g 样品)对不同的金属盐强化乙醇预处理样品酶解葡萄糖产率和增长率的影响。由图可知，除MgCl2强化的乙醇预处理样品外，其余金属盐强化的乙醇预处理样品均对葡萄糖得率明显提升，酶解72 h 后其葡萄糖得率分别提升至FeCl3（92.30%）、CrCl3（83.12%）、CuCl2（87.32%）、FeCl2（87.84%）、ZnCl2（86.93%）、MnCl2（85.36%）、MgCl2（48.63%）、CaCl2（64.56%）、NaCl（45.94%）和LiCl（38.32%）。这是因为茶皂素作为一种天然添加剂，能够促进纤维素酶在底物上的吸附，并介导吸附的酶的释放，同时减少酶对木质素的无效吸附[31-32]。对于葡萄糖增长率来说，茶皂素的加入随着酶解时间的延长仍然呈现先增加后减低的趋势，酶解72 h 后其葡萄糖增长率仍保持在3.19%～66.93%之间，这说明茶皂素的加入对不同金属盐强化的乙醇预处理杨木酶解均有很好的促进作用，加快了酶解速度，并且增加了最终葡萄糖得率。

2.4.3 BSA 的添加对预处理后杨木酶解效果的影响

添加剂牛血清白蛋白（BSA）的加入（40 mg/g 样品）对不同金属盐强化乙醇预处理样品酶解效果的影响如图6 所示。由图可知，酶解6 h 时，除了CrCl3和CuCl2强化的乙醇预处理杨木，BSA 的添加对其葡萄糖得率没有增加，随着酶解时间的延长，在酶解进行24 h 时其葡萄糖增长率达到最大，以CuCl2强化的乙醇预处理样品最为明显，达到44.17%。这是因为酶解过程中BSA 的加入可防止酶与底物中木素的非生产性吸附，提高酶解过程中的游离酶含量，进而提高酶解葡萄糖得率，同时BSA 还可以减少了外切葡聚糖酶的失活[33-34]。然而继续延长酶解时间至72 h 后，葡萄糖增长率相较24 h 时具有明显下降，但仍对CrCl3、CuCl2、MnCl2、MgCl2、NaCl和LiCl 等强化的乙醇预处理杨木的葡萄糖得率具有明显提升，使其最终的葡萄糖得率分别达83.58%、83.82%、80.31%、65.46%、25.64%和29.88%。

图6 BSA 的添加对不同金属盐强化乙醇预处理后杨木葡萄糖得率和葡萄糖增长率的影响Fig.6 Effects of BSA on glucose yield and increased glucose yield of poplar after different metal-salts catalyzed ethanol pretreatment

2.4.4 木聚糖酶的添加对预处理后杨木酶解效果的影响

木聚糖酶的添加(0.8 mg/g 样品)对不同金属盐强化乙醇预处理样品酶解葡萄糖得率和葡萄糖增长率的影响如图7 所示，除了FeCl3、CrCl3和MgCl2强化的乙醇预处理样品外，其余金属盐强化乙醇预处理样品在6 h 时均呈现不同程度的葡萄糖增长率（5.73%～34.30%），这是因为木聚糖酶通过部分溶解半纤维素，从而进一步增强酶对纤维素的可及性，同时与内切葡聚糖酶表现出良好的协同作用，进而提升酶解效率[35]。当酶解时间延长至24 h 时，CuCl2、MnCl2和MgCl2强化的乙醇预处理样品达到最大的葡萄糖增长率，然而随着酶解时间的延长（72 h），其葡萄糖增长率明显下降，但CuCl2、ZnCl2、MnCl2和NaCl 等金属盐强化的乙醇预处理仍对葡萄糖得率具有一定的促进作用，酶解72 h 后其葡萄糖得率分别达到86.63%、68.51%、84.30%和31.39%。这主要是因为经CuCl2、ZnCl2、MnCl2和NaCl 等金属盐强化的乙醇预处理后，仍有较多的半纤维素残留，残留的半纤维素在木聚糖酶的作用下发生降解，从而为纤维素酶提供更多的反应活性位点，进而提升其酶解效率[36-37]。

图7 木聚糖酶的添加对不同金属盐强化乙醇预处理后杨木葡萄糖得率和葡萄糖增长率的影响Fig.7 Effects of xylanase on glucose yield and increased glucose yield of poplar after different metal-salts catalyzed ethanol pretreatment

2.4.5 四种不同添加剂对酶解葡萄糖最终得率的影响

图8 对比分析了4 种添加剂的使用对不同金属盐强化的乙醇预处理样品酶解72 h 葡萄糖得率影响。如图可知，在酶解阶段加入吐温80，相较无添加剂的酶解，经FeCl3、CrCl3、CuCl2、ZnCl2、MnCl2、CaCl2、NaCl 和LiCl 预处理后样品酶解葡萄糖得率均有提升。在酶解阶段加入茶皂素，相较无添加剂的酶解，经FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2、MnCl2、CaCl2、NaCl 和LiCl 预处理后样品酶解葡萄糖得率均有提升。在酶解阶段进行BSA 的添加，相较于无添加剂的酶解，经CrCl3、CuCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2和CaCl2预处理的样品酶解葡萄糖得率有所提升。在酶解阶段加入木聚糖酶，相较无添加剂的酶解，经CuCl2、FeCl2、ZnCl2、MnCl2和NaCl预处理的样品酶解葡萄糖得率均有提升。由以上分析可知，吐温80、茶皂素、BSA 和木聚糖酶等添加剂的使用对不同金属盐强化的乙醇预处理样品的最终葡萄糖得率有不同程度的提升，同时添加剂的使用加快了酶解速度，缩短酶解时间，在吐温80 的作用下，FeCl3强化的乙醇预处理后样品酶解葡萄糖最高得率达93.44%。

图8 四种添加剂对不同金属盐强化乙醇预处理后杨木72 h 葡萄糖得率比较Fig.8 Effect of additives on the glucose yield after 72 h hydrolysis for different metal-salts catalyzed ethanol pretreated poplar

3 结论

本文研究了不同金属盐强化乙醇预处理对杨木化学组成、预处理液糖成分、微观物理结构和酶解葡萄糖产率的影响，并进一步研究了不同种类添加剂对杨木酶解葡萄糖得率和增长率的影响，主要结论如下：

1）通过对杨木进行不同金属盐强化乙醇预处理，发现三价和二价金属盐对半纤维素和木素的降解较为明显，通过对其进行SEM 和结晶度分析可知，其杨木纤维所形成的致密结构遭到破坏，纤维素含量的增加导致其相对结晶度升高，暴露更多的可接触位点，从而提升其酶解效率。不同价位金属盐对酶解葡萄糖得率的作用从强到弱排序为：三价金属盐、二价金属盐、一价金属盐。

2）通过分析4 种添加剂的加入对金属盐强化乙醇预处理杨木酶解葡萄糖得率和葡萄糖增长率的影响，发现添加剂的加入可提升酶解速度、缩短酶解时间、增加酶解效率。其中，添加剂吐温80 对金属盐强化乙醇预处理样品的适用范围最广，效果更优异，将吐温80 加入到FeCl3强化的乙醇预处理后杨木的酶解过程中，可获得最高的葡萄糖得率为93.44%。