DNA 甲基化在肺癌早期诊断中的研究进展

穆坎代斯·吐尔迪 夏宇（通讯作者）考吾沙尔·巴合提江 王萌萌

（新疆医科大学第一附属医院 新疆乌鲁木齐 830011）

从全世界范围来看，癌症死亡人数中占比最大的当数肺癌，根据GLOBOCAN（全球癌症流行病学的数据库）2020 年数据显示，新增肺癌患者高达220万例（占癌症患者总数的11.4%），死于肺癌的人数高达179 万例（占癌症总死亡人数的18.0%）。采用低剂量计算机断层扫描（LDCT）对肺癌患者进行初步筛查能够提高肺癌的诊断率，从而提高肺癌患者生存率。但是LDCT 的灵敏度高而特异性低容易造成误诊，因此通过LDCT 检测结果异常的患者需完善其他检查以进一步确认。因此，仍需寻找简便易行、灵敏度和特异性好的无创手段对肺癌进行早期诊断[1]。

由于DNA 甲基化与人类发育和肿瘤疾病密切相关，它是目前研究最透彻、最广泛的表观遗传学的现象之一。DNA 甲基化往往在肿瘤发病的早期甚至癌前病变时就已经发生，因此DNA 甲基化的异常改变或可成为用于肺癌早期诊断的生物标记物。为此本文主要就肺组织、外周血、肺泡灌洗液等标本当中DNA 甲基化检测与肺癌早期诊断的研究进展进行综述。

1 DNA 甲基化的定义

DNA 甲基化是一类可稳定遗传的表观修饰，其参与了个体发育及细胞分化等基本生物学过程。DNA 甲基化是指在DNA 甲基化转移酶的作用下，把甲基从通用甲基供体S- 腺苷-L- 甲硫氨酸添加到胞嘧啶的5-碳位置的一种化学修饰现象。这种方式能够通过改变DNA 的稳定性、DNA 和蛋白质的互作方式以及染色质结构来调控靶向基因的表达。多项研究表明，DNA 的异常甲基化主要表现为全基因组的低甲基化状态和启动子CpG 岛的高甲基化状态。

2 DNA 甲基化与肺癌

肺癌的发生发展涉及一系列异常的表观遗传变化。DNA 甲基化作为表观遗传的重要修饰手段之一与癌症的发病有密切关系，是正常细胞癌变时最早发生的事件。在癌变的早期阶段，不仅肿瘤细胞，甚至在非肿瘤细胞中也发生了异常的DNA 甲基化。抑癌基因失活的原因除了认为与碱基的突变和缺失有关外，另一个重要的原因被认为是其启动子区的高度甲基化。DNA 甲基化的异常在大部分时候早于癌性病变的发生，因此DNA 甲基化对于肺癌的早期诊断具有一定的临床意义。而且DNA 是一种非常稳定的分子，可以从大量体液中提取，DNA 甲基化的定量越来越准确和敏感，这是有效诊断标志物的关键特征，故通过测定基因DNA 甲基化水平能够为肺癌早期诊断和预后评估提供可靠的生物靶点。

3 DNA 甲基化在肺癌诊断中的应用

3.1 组织中DNA 甲基化检测与肺癌早期诊断

组织中抑癌基因的甲基化被证实与肺癌关系密切。Yang 等人研究了非小细胞肺癌（NSCLC）患者癌组织与癌旁组织中DAPK 基因启动子区域的甲基化状态，NSCLC 组织和癌旁组织中DAPK 甲基化频率差异有统计学意义，提示NSCLC 组织中DAPK 启动子甲基化的频率明显高于癌旁组织。Walter RFH 等人通过对肺癌患者的组织进行DNA甲基化分析发现，L1RE1 基因表现为低甲基化而RASSF1 表现为高甲基化，因此这两者结合可作为鉴别肺癌的生物标记物。李靖[2]收集105 位NSCLC 患者癌组织及其配对非癌组织样本分析，基因LDHB、PFKFB3、HK3、LDHC、PKLR 启动子的甲基化水平在配对的癌组织、癌旁组织和远端组织间的差异，发现LDHC 和HK3 启动子的甲基化水平在各组织样品中存在差异，有可能成为NSCLC 诊断的生物标志物。Feng X 等探讨了NID2 甲基化在NSCLC 发生发展中的意义，NSCLC 组织中NID2 甲基化率高于NCLL 组织，提示肿瘤组织中NID2 甲基化状态可能具有鉴定NSCLC 的潜力。

上述研究表明，组织中的甲基化检测可以区分肿瘤组织和正常肺组织，这为甲基化检测在肺癌早期诊断中的应用提供了理论基础。

3.2 外周血中DNA 甲基化检测与肺癌早期诊断

在肿瘤发生的整个病程中，位于癌细胞内的DNA 片段能够释放入外周循环，因此我们可以通过外周血测定DNA 甲基化的变化。Wenhai Huang 等对肺癌组的104 名患者和良性肺部疾病组的36 名患者的血浆进行了研究，发现SHOX2 和PTGER4都是检测恶性结节的高度特异性标记物，但敏感性较差，并推测可能的原因是血液样本中DNA 含量相对较少，肿瘤负荷较小。王攀等人[3]通过对肺癌患者血浆中DNA 甲基化的检测发现，与健康人群和良性肺部结节患者的甲基化结果相比，肺癌患者CDO1 基因甲基化的水平显著升高，且具有良好的诊断效能。Fujiwara K 等采用甲基化特异性PCR 方法检测了200 例患者的血清RAR-β、p16、DAPK、RASSFlA 和MGMT 基因甲基化状态，至少一个基因甲基化被评估为阳性时，诊断肺癌的敏感性和特异性分别为49.5%和85.0%，提示鉴定血清DNA 中抑癌基因的启动子甲基化可能有助于肺癌的早期检测。

抑癌基因的表观遗传失活对于肿瘤的发生发展至关重要，包括RASSF1A 在内的基因在许多肿瘤中均被证实发生了甲基化改变。因此，分析血液的生物标记物要求更高，标记物需要对肺癌DNA 具有真正的特异性，以确保进行高度特异性的肺癌检测。

3.3 支气管肺泡灌洗液中DNA 甲基化检测与肺癌早期诊断

支气管肺泡灌洗液（BALF）是通过支气管镜对肺段或亚段水平以下支气管及肺泡反复以无菌生理盐水灌洗、回收所得的混合液。目前支气管镜检查广泛应用于临床，获取BALF 比较简便，并且允许局部采样，相对靠近肿瘤细胞，定位相对准确，几乎没有来自身体其他部位的污染，特异性较强，是肺癌生物标志物比较理想的样本替代来源。Zeng D 等的一项研究发现，BALF 游离DNA（cfDNA）可以作为突变和甲基化分析的液体活检介质，与传统方法相比，在区分微小恶性肿瘤和良性结节方面具有更好的敏感性。崔超等人通过对BALF 样本中P16 基因的DNA甲基化检测发现，其对NSCLC 的诊断具有较好的敏感度和特异度，或可成为NSCLC 的诊断靶点之一。Hojoong Kim 等的研究表明，p16、RASSF1A、H-钙黏蛋白和RARB 基因的肿瘤特异性甲基化可能是BALF 中早期发现NSCLC 的一个有价值的生物标记物。Schmidt B 等在总共523 例患者支气管吸出物样本中，用实时定量PCR 的检测方法得出结论：SHOX2 基因甲基化能够以高度特异性区分恶性和良性肺部疾病。

对于外周性病变，气管镜无法直视下取活检的患者，采取BALF 甲基化检查加病理学检查有比较好的诊断准确率。

3.4 痰液中DNA 甲基化检测与肺癌早期诊断

痰液是BALF 的优选替代样本，其容易通过非侵入性方法获取，简单方便，易被患者接受。Hubers 等研究RASSF1A、3OST2 和PRDM14 联合检测肺癌，结果提示痰液DNA 甲基化检测具有早期诊断肺癌的能力，但需要补充诊断标志物来提高敏感性。彭再梅等人用甲基化特异性PCR(MSP)技术分别检测肺癌患者和良性肺结节患者组织中甲基化的异常，结果显示RASSFIA、p16 和DAPK 这3 个基因的启动子区域发生了甲基化改变，或可作为肺癌诊断的有效靶标。一项荟萃分析结果显示，p16、CDO1、ZFP42、RASSF1A、FAM19A4、TAC1、MGMT、FHI 和SOX17 的异常甲基化可作为早期肺癌筛查和诊断的生物靶标。

痰液样本的主要缺点是肺泡细胞含量的可变性，除非患者接受过如何制备痰标本的适当培训，否则大部分样本可能是不充分的。有研究表明，延长痰液收集的时间可以明显提高痰液中甲基化联合检测的灵敏度。

3.5 其他样本中DNA 甲基化检测与肺癌早期诊断

尿液已被证明是检测不同类型癌症（包括尿路上皮癌、结肠癌和肺癌）循环肿瘤DNA 中特定肿瘤基因突变的来源。与其他体液来源相比，尿液样本具有自己的优势，它们是非侵入性、易于获取、体积更大、易于收集的，与其他样本相比，它们的处理限制更小，可以在室温下储存，DNA 含量可以比其他体液稳定更长时间。正因为如此，尿液样本有可能在初级医疗保健实践中易于实施。但是尿液作为DNA 检测样本有其相应的限制性，尿液是血浆超滤液，只有一小部分的血浆DNA 可以被过滤到尿液中，一些甲基化的cfDNA 分子可能太小而无法检测。尽管存在这些差异，但尿液在癌症检测中的效用仍有待进一步探索。

呼出气体冷凝液（EBC）也可作为DNA 甲基化检测的样本，且它具有无创且样本收集简便的特点。EBC 中鉴定的化合物包括腺苷、氨、过氧化氢、异前列腺素、白三烯、氮氧化物（NOx）、肽、细胞因子、质子和各种离子。随着微阵列技术、测序技术以及生物信息分析技术的广泛应用，现如今对基因改变的识别已能够在微小样本（如EBC）中进行。收集EBC进行DNA 甲基化检测更适用于无法通过有创或微创手段获得样本进行诊断的肺癌患者。

4 展望

虽然DNA 甲基化测序技术不断改进，DNA 甲基化的检测样本来源从组织细胞、肺泡灌洗液、痰液、血液发展到呼出气冷凝液等，但各种检测样本和检测技术均有各自的优劣，暂无系统的标准化检测方案，仍然需要检测技术的不断进步予以弥补，使其更好地应用于临床。开发高灵敏度的表观遗传学生物标记物，用于有限数量的组织，并以非侵入性方式获得标本将是未来工作的重点。