姜黄素对高糖环境下大鼠肾小管上皮细胞凋亡影响

李 钰,包佩玲,谢 赛,虞典元,李 丹,冯爱桥

(1. 武汉科技大学附属孝感医院,湖北 孝感 432000;2. 武汉科技大学医学院,湖北 武汉 430000)

糖尿病是一种代谢性疾病,糖尿病肾病是糖尿病微血管病引起的常见并发症,是糖尿病患者死亡和残疾的主要原因之一[1]。流行病学研究显示,全世界约有40%的糖尿病患者会发展为糖尿病肾病,糖尿病肾病已成为慢性肾脏病的主要病因[2]。既往研究认为糖尿病肾病主要是肾小球疾病,然而越来越多的证据表明高糖环境下肾小管的损伤是导致肾间质纤维化的主要原因,抑制肾小管上皮细胞凋亡可以减轻蛋白尿,改善肾功能[3]。因此,可以把抑制肾小管上皮细胞凋亡作为治疗糖尿病肾病的有效靶点。 姜黄素具有广泛的生物活性,其能作用于多种信号通路,可降低血糖,改善胰岛细胞功能及炎症和氧化应激等造成的器官损伤[4],但姜黄素对高糖环境下肾小管上皮细胞凋亡是否有影响,目前相关研究较少。本研究探讨了姜黄素对高糖环境下肾小管上皮细胞凋亡的影响及其可能作用机制。

1 实验材料和方法

1.1材料 大鼠近端肾小管上皮细胞株(NRK-52E,购于上海中科院细胞库),姜黄素(Sigma公司),兔抗鼠Bcl单克隆抗体、兔抗鼠Bax单克隆抗体、山羊抗兔IgG 标记二抗(中杉金桥),彩色预染Marker(NEB),胎牛血清(Gibco公司),PCR引物及核苷酸序列(北京本元正阳基因技术有限公司),Annexin V/PI染液(BD公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养与传代 将大鼠近端肾小管上皮细胞株移入含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基,置于含5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培育,传代前先吸去上清液,用PBS洗培养板3次,用0.25%胰酶消化细胞,加入新的培养液,移液枪吹打细胞,使其悬浮,将细胞移至离心管,1 000 r/min离心5 min,移去上清,在沉淀物中加入新的培养液,更换新的培养板,显微镜下观察细胞,放入恒温培养箱中继续培养,每2～3 d传代1次。

1.2.2细胞冻存和复苏 取对数生长期的肾小管上皮细胞,倒出培养器皿内的培养基,用PBS洗涤细胞,加入0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞,再将细胞移入15 mL离心管中,于水平离心机上1 000 r/min离心5 min,倒掉胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养基,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,调节冻存液中细胞的终密度为(5～10)×106/mL。细胞复苏时,于4 ℃中平衡30 min,-20 ℃放置2 h,移入-70 ℃放置过夜,次日转入液氮中冻存。细胞复苏时将冻存管取出,迅速放入37 ℃水浴,不断晃动,保证快速完全解冻。移取细胞悬液至预先加入了培养基的离心管中,水平离心机1 000 r/min离心1 min,小心倒掉上清,加入培养基,轻柔吹吸几次重悬细胞,接种至培养瓶,置于含5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培育。

1.2.3细胞分组及干预 取对数生长期的肾小管上皮细胞,实验分为4组:对照组采用含5.5 mmol/L的D-葡萄糖培养基培养,高糖组采用含30 mmol/L的D-葡萄糖培养基培养,姜黄素低剂量组采用含30 mmol/L的D-葡萄糖和5 μmol/L姜黄素的培养基培养,姜黄素高剂量组采用含30 mmol/L的D-葡萄糖和10 μmol/L姜黄素的培养基培养。

1.3检测指标及方法

1.3.1细胞凋亡检测 细胞培养48 h后,收集细胞,500～1 000 r/min离心5 min,弃去培养液,用PBS缓冲液洗涤细胞1次,再次500～1 000 r/min离心5 min,弃去PBS,调节细胞浓度为(1～5)×106/mL,加入预冷的70%乙醇4 ℃固定1 h。弃去固定液,PBS重悬细胞5 min,用400目的筛网过滤细胞1次,500～1 000 r/min离心5 min。流式细胞仪激发光波长488 nm,用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光,另一波长大于560 nm的滤器检测PI,计算凋亡率。

1.3.2细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达情况 采用Western blot法检测:用细胞裂解液提取细胞中的总蛋白,用BCA试剂盒测定样品中蛋白质含量,蛋白样品与上样缓冲液Buffer按照1∶5的比例充分混匀,100 ℃煮沸变性8～10 min。取15 μg样品于SDS-PAGE进行电泳并转至硝酸纤维素膜,5%脱脂奶粉+TBST室温封闭2 h,滴加一抗(Bax 1∶2000,Bcl-21∶5 000),4 ℃孵育过夜后滴加二抗(1∶5 000),室温孵育1 h,ECL发光液孵育,胶片曝光,显影定影后用ImageScanner Ⅲ扫描仪获取图像,采用Quantity One图像分析软件进行半定量分析。

1.3.3细胞中Bax、Bcl-2 mRNA表达情况 收集细胞,提取细胞总RNA,利用primscriprt试剂盒进行单链cDNA合成,利用CFX96 (BIO-RAD)仪器进行实时定量RT-PCR,并在96孔板上进行单独的PCRs。引物序列:Bax上游引物为5’-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC -3’,下游引物为5’-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3’;Bcl-2上游引物为5’-GGATGCCTTTGTGGAACTGC-3’,下游引物为5’-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3’;β-actin上游引物为5’-CACACCTTCTACAATGAGCTG-3’,下游引物为5’-GTCTCAAACATGATCTGGGTC-3’。PCR条件:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s、 58 ℃退火15 s,循环40次,在每个循环结束后,在58 ℃测量荧光值。应用2-△△CT方法计算Bax、Bcl-2 mRNA相对表达量。

1.4统计学方法 采用SPSS 21.0进行统计学分析,各组计量数据比较采用方差分析,两两比较采用LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况 高糖组肾小管上皮细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);姜黄素低、高剂量组细胞凋亡率均明显低于高糖组(P均<0.05),且姜黄素高剂量组明显低于姜黄素低剂量组(P<0.05)。见图1。

图1 对照组和高糖环境下各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况

2.2各组大鼠肾小管上皮细胞中Bax及Bcl-2蛋白表达情况 与对照组比较,高糖组大鼠肾小管上皮细胞中Bax蛋白相对表达量明显增高(P<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量明显降低(P<0.05);姜黄素低、高剂量组大鼠肾小管上皮细胞中Bax蛋白相对表达量均明显低于高糖组(P均<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量均明显高于高糖组(P均<0.05),且姜黄素高剂量组Bax蛋白相对表达量明显低于姜黄素低剂量组(P<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量明显高于姜黄素低剂量组(P<0.05)。见图2。

图2 对照组和高糖环境下各组大鼠肾小管上皮细胞中Bax及Bcl-2蛋白表达情况

2.3各组大鼠肾小管上皮细胞中Bax及Bcl-2 mRNA表达情况 与对照组比较,高糖组大鼠肾小管上皮细胞中Bax mRNA相对表达量明显增高(P<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量明显降低(P<0.05);姜黄素低、高剂量组大鼠肾小管上皮细胞中Bax mRNA相对表达量均明显低于高糖组(P均<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量均明显高于高糖组(P均<0.05),且姜黄素高剂量组Bax mRNA相对表达量明显低于姜黄素低剂量组(P<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量明显高于姜黄素低剂量组(P<0.05)。见图3。

图3 对照组和高糖环境下各组大鼠肾小管上皮细胞中Bax及Bcl-2 mRNA表达情况

3 讨 论

肾小管间质占肾脏体积的90%以上,在糖尿病发生发展的过程中,高血糖水平、TGF-β、糖基化终末产物、ROS等因素均可导致肾小管损伤,损伤的肾小管上皮细胞表现为细胞增殖、凋亡、自噬和内皮-间充质转分化[5]。肾小管上皮细胞损伤后释放多种炎症因子和细胞因子,引起炎性细胞浸润,使细胞外基质沉积,间质纤维化,最终导致肾功能的恶化。高血糖状态促进肾小管上皮细胞凋亡是肾脏纤维化的主要原因,而进行性肾间质纤维化是糖尿病肾病的一个重要特征,也是导致慢性肾病及终末期肾脏病的重要因素[6-8]。新的研究表明,近端肾小管病变可能早于肾小球病发生,肾小管损伤标志物预测糖尿病肾病进展的价值优于肾小球病理学指标[9]。目前研究认为多种细胞因子及信号通路参与了高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的过程,如PI3K-Akt通路可与p38-MAPK通路共同介导肾小管上皮细胞凋亡,TGF-β、NF-κB、SAPK/JNK、AMPK等均可调节细胞的凋亡[10],各种触发细胞凋亡的因素均能触发肾小管上皮细胞凋亡。

姜黄素是从姜黄属中药姜黄、郁金、莪术等的块茎中提取出来的一种酚性色素,具有降脂、抗氧化、抗纤维化、抗氧化应激、降血糖、保护血管内皮功能等作用,在糖尿病肾病、急性肾损伤、慢性肾衰竭、药物性肾损害以及难治性狼疮性肾炎等疾病中均具有肾脏保护作用,且不良反应很小,具有重要的药用前景,是潜在治疗药物[11-12]。实验研究显示,姜黄素可改善糖尿病肾病大鼠的肾小球增大、基底膜节段性增厚,减轻肾组织氧化应激损伤[13];可抑制2型糖尿病大鼠海马细胞凋亡,对抗糖尿病引起的海马神经变性[14];可以通过下调Fas、Caspase-3蛋白表达而抑制心肌梗死大鼠的心肌细胞凋亡[15],还可以通过调控Bax和Bcl-2蛋白的表达抑制顺铂导致的肾小管上皮细胞凋亡[16]。在缺血再灌注大鼠动物模型中,姜黄素也有抑制肾小管上皮细胞凋亡的作用[17]。Zhang等[18]报道,姜黄素可通过调节Beclin1/UVRAG/Bcl2 抑制糖尿病肾病中的足细胞凋亡,加速细胞自噬。

本实验中观察到高糖处理可引起肾小管上皮细胞凋亡增加,促凋亡蛋白Bax蛋白及mRNA表达增加,抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白及mRNA表达降低,说明高糖可以诱导肾小管上皮细胞凋亡;给予姜黄素干预后,肾小管上皮细胞凋亡减少,Bax蛋白及mRNA表达降低,Bcl-2蛋白及mRNA表达增加,且高剂量姜黄素作用更明显,说明姜黄素可以抑制高糖环境下大鼠肾小管上皮细胞凋亡。姜黄素抗凋亡的机制可能与激活凋亡抑制基因、阻断细胞凋亡的执行等有关,但肾小管上皮细胞发生凋亡的机制很复杂,姜黄素可能的作用机制还需要深入探讨。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。