不同配伍比例“黄芪-黄连”药对干预对2型糖尿病胰岛β、α细胞的影响

李 捷,郑雅峰,徐云生

(1.山东中医药大学,山东 济南 250014;2. 山东中医药大学第二附属医院,山东 济南 250001)

2021年国际糖尿病联盟数据显示,目前全球确诊成年糖尿病已有5.366亿人,预估到2045年将上升至7.837亿,其中中国患者有1.409亿,发病人数位居世界首位[1]。2型糖尿病占全部糖尿病的90%以上,其防治形势十分严峻,给患者个人、家庭和社会都带来了巨大经济负担。作为影响国民健康的重大慢性非传染性疾病,2型糖尿病的防控研究是国务院《中国防治慢性病中长期规划(2017-2025年)》和科技部重大专项重点支持的研究项目。2型糖尿病的病理基础为胰岛β细胞功能受损和胰岛素抵抗(IR)。胰岛细胞主要为胰岛β、α细胞,两者维持动态平衡。其中胰岛β细胞维持正常形态和数量是机体分泌足够胰岛素的必要条件,其功能受损主要表现为β细胞分泌胰岛素的功能下降和细胞数量的减少,进而导致2型糖尿病的发生、发展[2]。胰岛α细胞约占所有胰岛细胞的20%,分泌胰高血糖素,具有很强的促进糖原分解和糖异生作用,可使机体血糖明显升高。2型糖尿病属于中医“消渴”范畴,为中医药治疗的优势病种,基本病机为阴津亏损、燥热偏盛,“热毒”是关键病因之一[3-4]。结合“脾脆善病消瘅”“脾虚致消”的主流观点,2型糖尿病的治则应以健脾益气清热为主。黄芪味甘、性微温,可健脾气,助运化,敛脾精,止消渴;黄连味苦、性寒,可清热燥湿解毒,清脾胃伏火。黄芪、黄连配伍,寒温并用,共奏健脾益气清热之效,临床上治疗2型糖尿病疗效确切[5-7],但目前对其不同配伍比例来治疗2型糖尿病的相关研究鲜有报道。本研究以2型糖尿病雄性大鼠为研究对象,观察不同比例黄芪-黄连配伍对大鼠胰岛β、α细胞影响,以期为临床应用“黄芪-黄连”药对治疗2型糖尿病提供理论支撑和实验依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 40只SPF级4周龄Wistar雄性大鼠,体重(130±10)g,购自北京维通利华公司,动物许可证编号:SCXK2016-0006。所有大鼠饲养于山东中医药大学动物屏障中心,自由摄食饮水,适应性喂养1周后用于实验。本实验严格按照国家实验动物福利伦理的相关规定执行。

1.2主要药物和试剂 黄芪、黄连使用道地药材,为甘肃产品,购自山东中医药大学第二附属医院,经山东中医药大学药学院专家鉴定符合《中国药典》相应要求。按照大鼠与成人体表面积换算法,取“黄芪-黄连”1∶1配伍比例(黄芪30 g、黄连30 g)、“黄芪-黄连”3∶1配伍比例(黄芪45 g、黄连15 g)药材煎煮,中药均先浸泡1 h,水煎2次(每次煮沸30 min),合并2次煎液,4层纱布过滤,浓缩至1 g/mL,放置室温备用。拜糖苹(阿卡波糖片,德国拜耳,国药准字H19990205,规格:50 mg/片);链脲佐菌素(STZ,美国Sigma,批号:18883-66-4);胰岛素一抗(批号:GB13121,中国Servicebio);胰高血糖素一抗(批号:GB13097,中国Servicebio);大鼠胰高血糖素酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(批号:CSB-E12800r,中国武汉华美);高糖高脂饲料(批号:19093212,中国北京科澳协力);柠檬酸钠(批号:2018010203,中国天津致远);柠檬酸(批号:2018-09-16,中国天津鼎盛鑫)。

1.3主要仪器 Axio Vert.荧光显微镜,德国Zeiss公司;ST8型离心机,美国Thermo Scientific公司;稳豪型血糖仪及配套血糖试纸,美国强生公司;ME235P电子分析天平,德国赛多利斯公司;-80℃超低温冰箱,日本SANYO公司;OLYMPUSAU2700全自动血生化仪,日本OLYMPUS公司;石蜡切片机及石蜡包埋机,德国LEICA公司;Multiskan GO 1510酶标仪,美国Thermo Scientific公司;Eppendorf5424R低温高速冷冻离心机,美国Eppendorf5424R公司;NanoDrop One分光光度计,美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.4实验方法 随机选6只大鼠作为空白组,余大鼠给予12周高糖高脂饲料(67%大小鼠维持饲料+20.0%蔗糖+10.0%猪油+2.5%胆酸钠+2.5%胆固醇)喂养以诱导IR,随后禁食12 h后称重,腹腔注射35 mg/kg STZ。72 h后大鼠尾静脉取血,采用罗氏血糖仪测量空腹血糖,非同日测得3次均≥16.7 mmol/L认定为2型糖尿病造模成功。剔除1只体重骤降和1只不成模的大鼠,将造模成功的大鼠随机分为模型组、“黄芪-黄连”1∶1组、“黄芪-黄连”3∶1组、拜糖苹组,每组8只。根据《人和动物间按体表面积折算的等效剂量》计算得出给药剂量,“黄芪-黄连”1∶1组给予黄芪、黄连各30 g水煎液灌胃,“黄芪-黄连”3∶1组给予黄芪45 g、黄连15 g水煎液灌胃,拜糖苹组给予拜糖苹60 mg/(kg·d)悬液灌胃,空白组和模型组给予等量蒸馏水灌胃,均1次/d,干预8周。

1.5检测指标及方法

1.5.1大鼠一般状态 观察记录各组大鼠造模后及灌胃干预后精神状态、活动、饮水、饮食等情况。

1.5.2空腹血糖、糖化血红蛋白及血清胰高血糖素水平 实验结束后各组大鼠禁食,采用戊巴比妥钠麻醉,无菌条件下解剖,腹主动脉取血5 mL,离心取上层血清,检测空腹血糖、糖化血红蛋白、胰高血糖素水平。

1.5.3免疫荧光双染观察胰岛β、α细胞分布情况及β/α细胞比值 大鼠取血后,无菌条件下取出适量胰腺组织,制备石蜡切片,常规预处理后进行抗原修复,加入自发荧光淬灭剂,血清白蛋白液封闭,在切片上滴加一抗(胰岛素和胰高血糖素)孵育过夜,洗涤,加相应二抗孵育,洗涤,滴加DAPI复染,使用抗荧光淬灭封片剂封片,通过生物荧光显微镜采集图像(胰岛素代表β细胞,胰高血糖素代表α细胞),观察胰岛β、α细胞分布情况,根据免疫荧光强度计算胰岛素与胰高血糖素的比值,即β/α细胞比值。

1.6统计学方法 实验数据采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析,计量资料多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠一般状态 与空白组比较,造模后各组大鼠精神萎靡,活动减少,毛发光泽度差且脱落严重,食量、饮水量、小便量明显增加,大便质稀。灌胃干预后,“黄芪-黄连”1∶1组、“黄芪-黄连”3∶1组、拜糖苹组大鼠一般情况较模型组大鼠均有不同程度的好转,其中“黄芪-黄连”3∶1组大鼠一般状况恢复最好并接近于空白组。

2.2各组大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白及血清胰高血糖素水平 模型组大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白及血清胰高血糖素水平均明显高于空白组(P均<0.05); “黄芪-黄连”1∶1组、“黄芪-黄连”3∶1组、拜糖苹组空腹血糖水平,“黄芪-黄连”3∶1组、拜糖苹组糖化血红蛋白水平及“黄芪-黄连”3∶1组血清胰高血糖素水平均明显低于模型组(P均<0.05);“黄芪-黄连”1∶1组糖化血红蛋白和“黄芪-黄连”1∶1组、拜糖苹组血清胰高血糖素水平也有下降趋势,但与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1。

图1 空白组和2型糖尿病各组大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、血清胰高血糖素水平

2.3各组大鼠胰腺组织β、α细胞分布情况 空白组大鼠胰岛β细胞聚集在胰岛中心,分布均匀且数量较多;α细胞分布以胰岛细胞周边为主,分布均匀且数量较少。与空白组相比,模型组大鼠胰岛形态破坏严重,胰岛中β细胞数量明显减少,而α细胞数量明显增加,且胰岛内部出现大量α细胞,提示胰岛结构紊乱。与模型组相比, “黄芪-黄连”1∶1组、“黄芪-黄连”3∶1组及拜糖苹组胰岛内部β细胞数量增加,α细胞数量减少,且排列变得规则有序。见图2。

红色荧光为胰岛素染色,代表β细胞;绿色荧光为胰高血糖素染色,代表α细胞图2 空白组和2型糖尿病各组大鼠胰腺组织免疫荧光染色表现(×200)

2.4各组大鼠胰腺组织β/α细胞比值 模型组β/α细胞比值明显低于空白组(P<0.05);“黄芪-黄连”1∶1组、“黄芪-黄连”3∶1组、拜糖苹组β/α细胞比值均明显高于模型组(P均<0.05), “黄芪-黄连”1∶1组、“黄芪-黄连”3∶1组、拜糖苹组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3。

图3 空白组和2型糖尿病各组大鼠胰腺组织中β/α细胞比值

3 讨 论

目前2型糖尿病患者临床表现大多没有“三多一少”的明显症状,而以体态肥胖(尤其腹型肥胖)、神疲乏力、不耐劳作等为主要表现。综观现代医学对2型糖尿病的理论认识并结合中医临床诊疗经验,笔者导师徐云生教授(岐黄学者)提出2型糖尿病核心病机特点为脾虚湿热,认为2型糖尿病的发生、发展及其并发症与脾胃的功能失调有密切关系,其治疗关键为健脾启枢清热,恢复中焦气机的升降。

黄芪、黄连配伍具有良好的健脾气、清湿热之效,二者分别及协同治疗2型糖尿病的相关研究已有文献报道。本项目组前期应用网络药理学联合基础实验初步明确了黄芪、黄连干预2型糖尿病的有效活性成分、作用靶点、参与的生物学过程及相关信号通路,其中黄芪可通过调控13个关键靶点(EGFR、KDR、SRC、ERBB2、FYN、ESR1、AR、HSP90AA1、PTGS2、ABCG2、AB1、MMP2、CYP1),提高酪蛋白激酶活性、调节脂质代谢、增强IR等途径来调控胰岛素信号通路,从而发挥治疗2型糖尿病的作用[8];黄连抗2型糖尿病过程中最显著的核心靶点为IL6、VEGFA和TNF,分子对接研究表明IL6、VEGFA和TNF能与黄连的所有活性化合物稳定结合,细胞实验结果进一步证实黄连可抑制IL-6和TNF-α的表达,增强胰岛细胞活力[9]。虞艳玮等[10]建立IR-HepG2细胞模型,加入“黄芪-黄连”含药血清进行观察,结果表明“黄芪-黄连”配伍可有效降低HepG2细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)mRNA表达水平。Mao等[11]研究也证实黄芪多糖和小檗碱联合应用可通过调节糖异生信号通路来减轻HepG2细胞的IR。Li等[12]采用16S rRNA基因测序技术检测验证黄芪可降低2型糖尿病小鼠血糖与体重,显著增加小鼠肠道菌群的丰富度和多样性,显著诱导乳酸杆菌和双歧杆菌的丰度增加。一项基于医院的回顾性队列研究表明,黄连颗粒治疗2型糖尿病的有效剂量为0.08 g/(kg·d),可明显降低患者血糖及三酰甘油、总胆固醇水平,且安全性良好[13]。Guo 等[14]研究显示黄连全组分颗粒可降低高脂饮食诱导的糖尿病大鼠血清单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、结缔组织生长因子(CTGF)水平及肾核因子-κB (NF-κB)表达水平。He等[15]实验证实黄连中的栀子碱对db/db小鼠具有抗肥胖、提高胰岛素敏感性的作用,可显著降低db/db小鼠体重、血脂水平和附睾脂肪重量;组织切片结果显示,该药能显著改善肝脏脂质代谢。但是目前关于黄芪、黄连不同配伍比例治疗2型糖尿病的研究很少。本研究结果显示,“黄芪-黄连”3∶1组大鼠的空腹血糖、糖化血红蛋白、血清胰高血糖素水平及“黄芪-黄连”1∶1组空腹血糖水平均明显低于模型组,提示“黄芪-黄连”配伍比例为3∶1时疗效更佳,推测是由于黄芪可以健运脾气,而黄连比例过大时对机体来说过于苦寒伤及脾胃的缘故,这也进一步验证了顾护脾气在临床上治疗2型糖尿病的重要性。免疫荧光检测显示,模型组大鼠胰岛中标记胰高血糖素的荧光强度显著增强,标记胰岛素的荧光强度明显减弱,β、α细胞排列紊乱,比例失衡;“黄芪-黄连”两种配伍比例的中药水煎液干预8周后,大鼠胰岛中标记胰高血糖素的荧光强度明显减弱,标记胰岛素的荧光强度明显增强,β、α细胞恢复正常的排列顺序和比例,提示“黄芪-黄连”两种配伍比例均能够改善β、α细胞的失衡状态,恢复胰岛细胞功能,不同配伍比例未显示出明显差异,推测为干预时间过短的原因。今后将进一步完善相关研究,探讨黄芪、黄连配伍调节胰岛功能的具体机制,为中医药临床治疗2型糖尿病提供更加科学有力的证据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。