思肤安营养修护仿生膏对痤疮大鼠皮损及IGF-1/PI3K/Akt信号通路的影响

张旭冉,梁 嫔,蒋 思,郑楷平,刘 琴

(武汉大学中南医院,湖北 武汉 430071)

痤疮是一种常见的累及毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病,表现为粉刺、丘疹、脓疱、结节、囊肿等多形性炎症性皮损,预后可遗留萎缩或增生性瘢痕,对患者情绪、社交、工作等影响巨大。近年来多项研究表明皮脂的定量和定性变化是所有痤疮发病特征的初始改变,皮脂的成分及比例变化与痤疮发病密切相关[1-5]。思肤安营养修护仿生膏为自主研发的一款仿生护理膏,它模拟了人类健康皮脂组分,由20%亚麻酸、60%亚油酸和2%卵磷脂组成。临床实践中发现使用思肤安营养修护仿生膏可以缓解痤疮患者面部炎症及非炎症皮损,且患者耐受性良好[6],但其调节脂质及治疗痤疮的机制仍需进一步研究。本实验观察了思肤安营养修护仿生膏对痤疮大鼠皮损的影响,并基于胰岛素样生长因子1(IGF-1)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路探讨了其可能的治疗机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 18只SPF级雄性SD大鼠,鼠龄28 d,体重(130±20)g,购自湖北贝恩特生物科技有限公司,动物使用合格证号:SCXK(鄂)2021-0027。大鼠饲养于武汉大学中南医院SPF级动物实验中心,在统一饲养标准下喂养,饮用水、饲料、笼盒及垫料均经过高温高压灭菌处理,饲料、垫料等物品均由武汉大学中南医院实验动物中心提供。实验经武汉大学中南医院动物伦理委员会同意(伦理批准编号:ZN2022043)。

1.2实验耗材与仪器 痤疮丙酸杆菌菌液(编号:330605)、哥伦比亚血平板(北纳公司),思肤安营养修护仿生膏(武汉市阳逻经济开发区阳逻港华中国际),阿达帕林凝胶(黑龙江福和制药集团股份有限公司),SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、RIPA总蛋白裂解液、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒、100xPMSF、磷酸化蛋白酶抑制剂、5x蛋白上样缓冲液、丽春红染液、TBS(粉剂)、电泳液(粉剂)、转膜液(粉剂)、IGF-1抗体(ABclonal,A0303)、PI3K抗体(三鹰,60225-1-Ig)、Akt抗体(三鹰,10176-2-AP)、SREBP-1抗体(SC-13551)、抗体洗脱液、显影定影液、Tween-20、脱脂奶粉均购自武汉佰仟度生物科技有限公司,Protease Inhibitor Cocktail(ROCHE)、蛋白Marker(Thermo)、0.45 μm PVDF膜(Millipore)、柯达医用X射线胶片、免疫组化染色超敏试剂盒、DAB显色试剂、PBS缓冲液购于Affinity Biosciences,正置荧光显微镜(日本奥林巴斯,型号:BX53),全自动数字玻片扫描与分析系统(德国徕卡,型号:Aperio VERSA 8),暗匣(广东粤华医疗器械厂有限公司),扫描仪L4158(EPSON),台式离心机(上海安亭科学仪器厂),冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司),制冰机(常熟市雪科电器有限公司),脱色摇床(北京市六一仪器厂)。

1.3实验方法 分别在大鼠背部左上、左下、右上、右下选取4处1.5 cm×1.5 cm大小正方形区域,每个区域皮内点状均匀注射100 μL痤疮丙酸杆菌悬液(8×107CFU/mL),连续7 d,建立痤疮模型。造模成功后,用水性笔在尾巴根部标记上1～18的数字,按随机数字法将其分为对照组、阿达帕林组及思肤安组,每组6只。对照组、阿达帕林组及思肤安组每日17:00分别于皮损处涂抹生理盐水、阿达帕林凝胶、思肤安营养修护仿生膏1次,连续干预4周。

1.4检测指标及方法 分别于干预2周及4周后观察皮损情况,取大鼠皮损组织行相关检测。

1.4.1皮损组织病理形态 切取大鼠背部皮损处组织,每块长约0.5 cm×0.5 cm,进行固定脱水,制作石蜡包块,切片后进行HE染色,20倍视野显微镜下观察皮损组织病理形态。

1.4.2皮损组织尼罗河红荧光染色及皮损脂质百分比 冰冻切片,固定液固定10 min,蒸馏水洗3次,每次3 min,加入尼罗河红染色液染色5～10 min,洗涤。用365 nm波长激发,细胞核为蓝色,脂滴为红色。50倍显微镜下取5个不重叠的视野,使用Image J软件计数5个单位视野内脂滴数量,计数取平均值。

1.4.3皮损组织中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1表达情况 分别采用Western blot法检测和免疫组化法观察。

1.4.3.1Western blot检测方法 取皮损组织块,用预冷的PBS缓冲液漂洗2～3次,去除血污,剪成小块置于高速低温研磨仪专用离心管中,加入10倍于组织体积的组织蛋白提取试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),高速研磨。将匀浆液转移至离心管中,振荡,冰浴裂解30 min,期间用移液器反复吹打,确保匀浆液完全裂解。4 ℃下13 000×g离心5 min,收集上清,即为总蛋白溶液,BCA法检测蛋白浓度。按浓缩胶50 V、分离胶120 V进行恒压电泳,至溴酚蓝到达胶板下沿。按100 V恒压转膜,转膜时间根据目的蛋白分子量大小调整。将转好的膜加入封闭液室温封闭1 h,除去封闭液,加入已稀释好的一抗4 ℃过夜。回收已稀释的一抗,用TBST洗3次,每次5 min。加入稀释好的二抗,室温孵育30 min,用TBST在室温下摇床上洗4次,每次5 min。根据不同的光强度调整曝光条件,显影、定影。将胶片扫描存档,IPWIN60软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.4.3.2免疫组化染色观察方法 取大鼠皮损组织并制备石蜡切片,脱蜡,水化,3%过氧化氢浸泡5 min,PBS缓冲液浸泡2 min。使用IGF-1、PI3K、SREBP-1、Akt抗体,根据一抗说明书选择合适的修复方式进行抗原修复,一抗孵育,复温,二抗孵育,显色,复染,脱水,透明,封片。40倍显微镜下采集5个视野的图片。

1.5统计学方法 使用EXCEL整理记录实验数据,应用SPSS 25.0统计分析软件对结果进行统计分析。计量资料组间比较采用单因素方差分析,如果组间差异有统计学意义,进一步采用LSD方法进行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠背部皮损大体情况 造模第7天,各组大鼠造模部位皮损基本一致,造模部位均有大量丘疹、脓疱、粉刺、破溃、结痂等皮损,皮损基底皮肤呈暗红色,无明显渗液。干预2周后,各组大鼠背部皮损处红肿、丘疹、结节较前均有好转,思肤安组、阿达帕林组背部皮损处结节、红肿较对照组轻。干预4周后,对照组仍可见片状红斑、丘疹,思肤安组及阿达帕林组丘疹、结节基本消退,其中思肤安组皮损处皮肤更光滑、凹陷性瘢痕更少,毛发更多。见图1。

图1 各组痤疮大鼠背部皮损大体情况

2.2各组大鼠皮损组织HE染色病理学形态 造模第7天,对照组痤疮皮损处毛囊漏斗部扩张,大量角质物堆积其中,毛囊壁及周围组织内伴大量以中性粒细胞为主的炎细胞浸润。干预2周后,思肤安组及阿达帕林组毛漏斗内角质物、毛囊壁及周围组织炎细胞浸润均较对照组减少。干预4周后,思肤安组、阿达帕林组表皮各层结构组织基本正常,分界清晰,炎性细胞浸润更少。见图2。

图2 各组痤疮大鼠背部皮损组织HE染色病理形态 (×20)

2.3各组大鼠皮损组织尼罗河红荧光染色及脂质百分比 对照组干预2周及4周后脂质百分比均明显低于造模第7天(P均<0.05),但干预2周后与干预4周后比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组干预2周后相比,阿达帕林组脂质百分比明显降低(P<0.05),思肤安组脂质百分比明显升高(P<0.05)。与对照组干预4周后相比,阿达帕林组及思肤安组脂质百分比均明显降低(P均<0.05),且阿达帕林组明显低于思肤安组(P<0.05);思肤安组皮损脂质百分比呈现先上升后下降的趋势,干预4周后脂质百分比与阿达帕林组干预2周后相当(P>0.05)。见图3及图4。

图3 各组痤疮大鼠背部皮损组织尼罗河染色表现(×50)

图4 各组痤疮大鼠背部皮损组织尼罗河染色脂质百分比

2.4各组大鼠皮损组织中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白表达情况 Western blot法检测,干预2周、4周后阿达帕林组和思肤安组皮损组织中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白相对表达量均明显低于对照组(P均<0.05),且思肤安组均明显低于阿达帕林组(P均<0.05),见图5。免疫组化观察,干预2周、4周后思肤安组和阿达帕林组皮损组织中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白表达均较对照组明显减少,见图6。

图6 免疫组化检测各组痤疮大鼠皮损组织中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白表达情况(×40)

3 讨 论

越来越多的研究认为痤疮是一种皮脂腺代谢性疾病,脂质代谢的紊乱贯穿了痤疮发生发展的各个环节[7]。皮脂腺细胞可在有或无内外诱因下产生促炎介质和中性粒细胞趋化因子,而其分泌的皮脂所含有的部分游离脂肪酸又具有广泛的抗菌活性,因此皮脂定量和定性的不同可表现出不同的促炎或抗炎特性。研究表明,皮脂成分的改变较皮脂分泌总量的升高在痤疮的发生发展中具有更重要的作用[8]。痤疮患者皮脂中角鲨烯水平升高,亚油酸水平降低;治疗后,痤疮患者皮脂中过氧化脂质尤其是过氧化鲨烯的含量显著降低,而高水平的亚油酸成分可减少粉刺的发生[8]。因此,脂质组学在痤疮发病和治疗中的作用也受到了越来越多的关注。研究显示,饮食Omega-3脂肪酸和(或)亚油酸可以辅助治疗痤疮[9-11],而膳食补充的有效成分作用于皮肤的功效是有限的,若能有药物直接作用于皮肤、调节脂质代谢,则治疗效果将会更佳。

本研究中所使用的思肤安营养修护仿生膏正是基于此理念自主研发的一款仿生护理膏,由亚麻酸、亚油酸和卵磷脂组成。亚麻酸具有有效的5α-还原酶抑制作用和抗炎作用[12],亚油酸可下调中性粒细胞的氧代谢和吞噬作用[13],卵磷脂通过减少角质层的水分损失和降低角质细胞中脂褐素的含量来维护皮肤屏障功能[14]。本实验以阿达帕林为阳性对照,探讨了思肤安对痤疮大鼠的干预效果及可能机制,结果显示思肤安营养修护仿生膏及阿达帕林均可促进痤疮皮损处结节、红肿消退,干预4周后思肤安组大鼠造模处的皮肤较阿达帕林组更光滑、凹陷性瘢痕更少,毛发更多,皮肤屏障功能修复表现更佳。在脂质调节方面,思肤安组皮损脂质百分比呈现先上升后下降的趋势,干预 4周时思肤安组抑制脂质分泌的效果稍劣于阿达帕林组,与使用阿达帕林2周作用相当。此结果和思肤安营养修护仿生膏本身性质有关,因该制剂模拟了皮脂组分,短期使用可能会造成外来脂质的增加,而随着其本身对脂质代谢的调节作用,继续使用则呈现脂质下降的趋势。此外,蛋白印迹及免疫组化结果均显示思肤安组皮损组织中IGF-1、PI3K、Akt、SREBP-1蛋白表达显著减少,且减少较阿达帕林组更显著。SREBP是一种调节胆固醇和脂肪酸的主要转录因子,它在脂代谢的作用机制中至关重要,而IGF-1/PI3K/Akt通路是其主要的上游调控因子。因此推测思肤安营养修护仿生膏下调了IGF-1通路,随后抑制PI3K/Akt通路,导致前体和成熟形式的SREBP-1减少,从而使得皮肤脂质中的胆固醇和脂肪酸代谢降低而起到了治疗作用。虽然未能进行大鼠皮损的脂质分析,但推测思肤安营养修护仿生膏的脂质调节作用导致的游离脂肪酸如棕榈酸、亚油酸等浓度的变化也可以导致炎症的减轻,从而发挥治疗作用。

综上所述,思肤安营养修护仿生膏可以有效改善大鼠痤疮皮损,且有一定的脂质调节作用,其治疗痤疮的机制可能与抑制IGF-1R/PI3K/Akt通路,从而下调SREBP-1的表达有关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。