橙皮苷干预心肌梗死进展的机制研究

褚智君,张少华,任冬飞,谢 琪,周腾腾,张红梅,吴香婷

(1. 唐山工人医院,河北 唐山 063000;2. 河北省第八人民医院,河北 石家庄 050011;3. 河北医科大学第四医院,河北 石家庄 050011;4. 邯郸市第一医院,河北 邯郸 056002)

心肌梗死是全球发病率和病死率较高的疾病之一,虽然近年来支架技术、手术技术、辅助药物治疗等先进方法被广泛用于心肌梗死的治疗,然而患者的预后仍然较差[1-2]。目前研究认为,在急性心肌梗死缺血再灌注期间及心肌梗死后的慢性重塑过程中,氧化应激均会导致心肌损伤。线粒体内产生的活性氧是缺血再灌注损伤的特殊驱动因素,包括诱导线粒体通透性改变或线粒体内结构和分子的氧化损伤[3]。自噬是一种吞噬自身不必要的和功能失调的蛋白质、细胞器和其他细胞成分的降解和再循环过程[4],其中线粒体蛋白的泛素化标记受损的线粒体,以便通过线粒体自噬降解,而SQSTM1/p62参与线粒体自噬过程中线粒体蛋白的泛素化[5]。心肌细胞在缺氧条件下较早发生自噬,启动细胞保护机制。另外心肌梗死后会出现强烈的全身性和局部炎症反应,炎性细胞数量随着心肌缺血的进展而动态变化,炎症标志物如白细胞介素-1β(IL-1β)在心肌梗死后表达增加[6]。橙皮苷为中药陈皮中的活性成分,具有抗肿瘤、抗氧化应激、抗炎、降胆固醇和降血糖等多种药理作用[7-8]。本研究从线粒体自噬、氧化应激及炎症方面探究了橙皮苷预干预对心肌梗死小鼠的影响,以期为橙皮苷药物的开发利用提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级C57BL/6小鼠12只,雌雄各半,6～8周龄,体重20～22 g,购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司,许可证号:SCXK(豫)2020-0005。在温度20～24 ℃、湿度45%～55%、12 h光/暗循环的环境下常规饲养。本研究所有涉及动物的程序均按照NIH《实验动物护理和使用指南》进行,并得到河北医科大学第四医院医院审查委员会的批准。

1.2药品及仪器、试剂 橙皮苷标准品(纯度≥98%)SND-1692购自滁州仕诺达生物科技有限公司,饿酸GP18456、醋酸双氧铀GZ02625和柠檬酸铅GA10701购自北京中镜科仪技术有限公司,苏木素染液DH0008、伊红染液DH0045购自北京雷根生物技术有限公司,动物超声成像系统Vevo F2购自FUJIFILM VisualSonics公司,透射电子显微镜(TEM)H-7500购自日本日立公司。RIPA裂解液(P0013K)和4%多聚甲醛固定液(P0099)购自江苏碧云天生物科技有限公司,BCA蛋白定量测定试剂盒(PC0020)和2.5%戊二醛固定液(P1126)购自北京索莱宝科技有限公司,PVDF膜(IPVH20200)购自美国Millipore公司。PINK抗体(ab135897)、Parkin抗体(ab77924)、p62抗体(ab109012)、NOX2抗体(ab129068)、NOX4抗体(ab154244)、IL-1β抗体(ab234437)和GAPDH抗体(ab8245)购自美国Abcam公司,LC3-Ⅰ/Ⅱ抗体(ABC929)购自Sigma-Aldrich公司。

1.3实验方法 将12只小鼠随机分为模型组和橙皮苷组,每组6只。从实验第1天开始,橙皮苷组给予36 mg/kg橙皮苷(剂量根据预实验确定)灌胃,模型组给予等体积无菌生理盐水灌胃,均1次/d,连续7 d。实验第8天,用2%异氟醚麻醉2组小鼠后对其进行气管插管和通气,在左侧第3、第4肋间隙通过开胸术充分暴露心脏后,结扎冠状动脉左前降支造成心肌梗死,尽量快速关胸,缝合皮肤。

1.4检测指标及方法

1.4.1超声心动图 术前及心肌梗死造模后24 h使用2%异氟醚吸入麻醉2组小鼠,使用经胸M型超声心动图和动物超声成像系统测定心功能,计算左心室缩短分数(FS)和射血分数(EF)。

1.4.2心肌组织病理形态 造模后24 h处死所有小鼠,取出心脏,用4%多聚甲醛溶液固定24 h,进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡等操作后,石蜡包埋并连续切成6 μm厚的切片,然后进行苏木素染液和伊红染液染色,进行梯度乙醇脱水,二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明,并使用中性树胶封固,镜下观察。

1.4.3心肌组织、线粒体及自噬小体超微结构 收集小鼠的心肌组织(冰上切成1 mm×1 mm×1 mm大小),使用2.5%戊二醛在4 ℃固定24 h、1%锇酸在4 ℃固定1 h后,进行梯度乙醇脱水,然后包埋在环氧树脂中,超薄切片机切片(50 nm),随后醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色,在透射电镜下观察心肌组织、线粒体及自噬小体超微结构并拍照。

1.4.4线粒体自噬、活性氧及炎症相关蛋白表达情况 采用Western blot法检测:取小鼠的心肌组织,放入低温PBS中,冰上研磨,用胰酶反复消化2～3 min,终止消化后,取上清液,离心,放入培养基中培养。用RIPA裂解液裂解提取蛋白质,使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。将蛋白样品(20 μg)上样在预制的 SDS-PAGE 凝胶中,然后电泳分离,转移到PVDF膜上,在室温下用5%脱脂牛奶封闭膜1 h,然后与稀释的一抗PINK抗体、Parkin抗体、p62抗体、LC3-Ⅰ/Ⅱ抗体、NOX2抗体、NOX4抗体、IL-1β抗体和GAPDH抗体在4°C孵育过夜,使用TBST洗涤后,将膜与辣根过氧化物酶耦联的二抗在室温下孵育1 h,TBST洗涤后,加入ECL发光液对蛋白进行显影。使用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.5统计学方法 使用SPSS 23.0软件进行统计分析,计量资料组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.12组小鼠超声心动图 造模前2组小鼠的FS和EF比较差异均无统计学意义(P均>0.05);造模后24 h,橙皮苷组小鼠的FS和EF均明显高于模型组(P均<0.05)。见图1。

图1 模型组和橙皮苷组小鼠超声心动图 FS和EF

2.22组小鼠心肌组织病理形态 模型组见左室透壁性坏死的心肌和纤维组织,心肌细胞排列紊乱,横纹不整齐,有大量炎性细胞浸润和明显的均质红染;橙皮苷组见左室梗死区明显减小,心肌细胞结构基本完整,肌纤维排列基本整齐,炎性细胞浸润较少。见图2。

图2 模型组和橙皮苷组小鼠心肌组织HE染色表现

2.32组小鼠心肌组织及线粒体超微结构 模型组心肌细胞肌原纤维排列紊乱,肌丝断裂,线粒体嵴消失较多,线粒体中出现大量空泡;橙皮苷组心肌细胞肌原纤维排列基本整齐,肌丝无明显断裂,线粒体嵴部分消失,线粒体中出现空泡较少。见图3。

图3 模型组和橙皮苷组小鼠心肌组织及线粒体超微结构(×20000)

2.42组小鼠心肌组织自噬小体超微结构 自噬小体出现在线粒体旁,橙皮苷组中的自噬小体数量明显多于模型组(红色箭头示)。见图4。

图4 模型组和橙皮苷组小鼠心肌组织自噬小体超微结构

2.52组小鼠心肌组织中线粒体自噬相关蛋白表达情况 橙皮苷组PINK、Parkin、p62和LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)。见图5。

图5 模型组和橙皮苷组小鼠心肌组织中线粒体自噬相关蛋白表达情况

2.62组小鼠心肌组织中活性氧及炎症相关蛋白表达情况 橙皮苷组NOX2、NOX4和IL-1β蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)。见图6。

图6 模型组和橙皮苷组小鼠心肌组织中活性氧及炎症相关蛋白表达情况

3 讨 论

心肌梗死导致心肌缺血和缺氧,从而诱导活性氧的产生,活性氧介导的心肌梗死后心脏氧化应激在促炎细胞因子释放、心肌细胞凋亡和纤维化等心脏重构的发病机制中起着重要作用[9-10]。活性氧可刺激炎症因子的产生,炎症因子反过来促进活性氧的形成,导致缺血心肌的氧化应激和炎症反应级联放大,导致心脏受损恶化[11-12]。目前研究表明,NADPH氧化酶NOX2或NOX4或线粒体是活性氧的主要来源,NOX和线粒体之间的相互作用被称为“活性氧诱导的活性氧释放”,被认为是局部活性氧产生组织氧化还原信号的正前馈机制[13-14],生理情况下活性氧是参与细胞增殖、迁移、分化和基因表达等多种生物反应的氧化还原信号的重要组成部分[15-16]。

线粒体选择性自噬是线粒体损伤后线粒体质量控制的一种机制。线粒体自噬在缺血再灌注损伤期间通过去除受损的线粒体并减轻其对心肌细胞的有害后果(包括氧化应激)起到保护作用[17-18],线粒体自噬缺陷不能清除缺血再灌注损伤引起的受损线粒体,导致线粒体基因组崩溃、线粒体受损、心磷脂氧化、氧化应激、mPTP打开,最终导致线粒体凋亡[19-20]。PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬缺乏可导致线粒体活性氧的产生,线粒体受损时,PINK1在线粒体外膜聚集,泛素磷酸化后,胞质E3泛素连接酶Parkin被大量激活,使各种线粒体内蛋白泛素化,从而招募和激活更多的Parkin[21-23]。LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ是自噬小体形成的重要步骤,LC3-Ⅱ的丰度与自噬小体的数量相关,自噬增加可减少炎症因子如IL-1β等的表达[24]。尽管早期自噬是有益的,但不受调节和持续的自噬可能是有害的,并导致自噬细胞死亡。

本研究结果显示,橙皮苷组小鼠的心功能、心肌组织受损情况轻于模型组,部分线粒体嵴消失,线粒体中空泡较少,自噬小体数量明显多于模型组;心肌组织中PINK、Parkin、p62和LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白相对表达量高于模型组,NOX2、NOX4和IL-1β蛋白相对表达量低于模型组。说明橙皮苷可抑制心肌梗死导致的心肌组织损伤,其可能通过促进线粒体自噬、抑制炎性反应及氧化应激反应而发挥心肌保护作用。本实验结果为橙皮苷用于心肌梗死的治疗提供了一定理论依据,但其作用还有待深入研究。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。