黄芪莪术药对调控Akt/FoxO3a信号通路对胃癌前病变的影响研究

黄柳向,何凡应,李 玲

(1. 湖南中医药大学第一附属医院,湖南 长沙 410007;2. 郴州市中医医院,湖南 郴州 423000;3. 湖南中医药大学,湖南 长沙 410208)

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,是在多种复合因素共同作用下产生的结果,幽门螺杆菌感染是其最主要的危险因素[1]。该病的发病机制尚未明确,无法进行准确的一级预防,但从正常的胃黏膜向胃癌转变,一般要经历一段长时间的胃癌前病变过程,是慢性胃炎转变为胃癌的一个重要中间阶段,其病理表现主要包括肠上皮化生和异型增生[2]。 目前逆转癌前病变的治疗手段主要有根除幽门螺杆菌、修复胃黏膜以及对消化不良的对症治疗、内镜下切除胃癌前病变组织等,但效果有限。随着对中医药研究的深入,发现中医药可改善胃癌前病变临床症状及逆转胃镜下组织病理学变化[3]。黄柳向教授认为胃癌前病变的主要病机为脾胃气虚弱,痰瘀互结,总结出了益气活血、健脾化痰的基本治法,临床上常用莪蚕健胃方(主要由黄芪、莪术、炒僵蚕、穿山甲、百合、当归、炒枳壳、太子参、鸡内金等组成)治疗胃癌前病变。前期研究发现,莪蚕健胃方不仅可抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,还可削弱缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白和mRNA表达,抑制血管新生,从而逆转胃癌前病变[4-6]。黄芪、莪术是莪蚕健胃方中的两味君药,奠定全方益气活血的主要功效,且这两味中药具有多种抗肿瘤活性成分,可以通过多条通道对胃癌前病变起到治疗作用,其中蛋白激酶B(Akt)/叉头状转录因子O亚族3(FoxO3a)信号通路就是关键的一条。刘世佳[7]研究表明,埃索美拉唑可以通过影响Akt/FoxO3a信号通路来抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖。本研究基于Akt/FoxO3a信号通路探讨了黄芪-莪术药对逆转胃癌前病变的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 48只雄性Wistar大鼠,体重100～120 g左右,购于上海市计划生育科学研究所实验动物经营部,许可证号:SCXK(沪)2018-0006,饲养于温度20～26 ℃、湿度40%～70%环境中,保持昼夜节律,白昼黑夜各12 h,自由进食饮水,适应性喂养1周。

1.2实验药物 甲基硝基亚硝胍 (MNNG)溶液(货号:K21171191,阿拉丁);黄芪-莪术药对(黄芪饮片30 g、莪术饮片10 g,批号:200839,湖南省中医院研究院),加水浸没中药上方2 cm,大火熬制40 min,去渣,将药液浓缩至0.36 g/mL低温保存备用;叶酸(批号:210307,福州海王福药制药有限公司);盐酸雷尼替丁(批号:306210801,苏州弘森药业股份有限公司)。

1.3实验试剂及器材 苏木素染液(ZLI-9610,中衫金桥);伊红染色液(G1100,Solarbio);超净高级封片胶(YZB,BASO);Scott蓝化液(G1865,Solarbio);TRIzol Reagent (CW0580S,CWBIO 康为世纪);HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(R223-01,Vazyme 诺唯赞);2×SYBR Green PCR Master Mix(A4004M,Lifeint 生命互联);Akt1 (10176-2-AP,Proteintech,1/500);FoxO3a(af5128,affinify,1/500);LC3-I/II(af5402,affinify,1/500)。扫描显微镜(VS200,OLYMPUS);切片机(2235,Leica);电热鼓风干燥箱(HGZF-101-1,上海跃进医疗器械有限公司);微型离心机(D1008E,SCJLOGEX);旋涡混合器(XH-C,常州越新仪器制造有限公司);干式电加热器(GL-150,海门市其林贝尔仪器制造有限公司);低温高速离心机(5424R,Eppendorf);荧光PCR仪[CFX ConnectTM实时,伯乐生命医学产品(上海)有限公司];低温高速离心机(5424R,Eppendorf);全自动样品快速研磨仪(Tiss-12,上海净信实业发展有限公司)。

1.4实验方法 随机选择12只大鼠作为正常组,正常饲养;其余大鼠采用MNNG联合饥饱失常情绪激惹饲养[8]建立胃癌前病变模型:用避光的MNNG(100 μg/mL)作为大鼠的饮用水,从造模第4周末开始,对大鼠采用单日禁食、双日足量进食方法饲养,并每天给予雷尼替丁溶液灌胃,在造模期间每周二、周五灌喂2次40%乙醇水溶液,每次1 mL,持续16周,在16周末、20周末随机从抽选3只大鼠,麻醉后剖腹取胃,从胃体、胃窦处取材进行HE染色,镜下观察胃黏膜是否出现肠上皮化生、异型增生,确认造模是否成功。将造模成功的大鼠随机分为模型组、黄芪-莪术组、叶酸组,每组10只,均给予标准饲料喂养。正常组和模型组给予蒸馏水灌胃,黄芪-莪术组给予黄芪-莪术水煎浓缩液3.6 g/kg灌胃,叶酸组给予叶酸1.8 mg/kg灌胃, 均1次/d,连续灌胃10周。

1.5检测指标及方法

1.5.1大鼠一般状况 详细记录观察前期造模和后期干预过程中各组的体重、毛发、活动度、精神状态、饮食状况等。

1.5.2胃组织病理形态 灌胃结束后,每组取6只大鼠麻醉处死,取一半胃组织,先将组织在流水下冲洗数小时,然后再以70%,80%,90%浓度的乙醇溶液对组织依次脱水,再将组织放入纯酒精、二甲苯各半混合液15 min,二甲苯Ⅰ溶液15 min、二甲苯Ⅱ溶液15 min(直到透明为止)。放入二甲苯和石蜡等量的混合液15min,石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ进行透蜡各50～60 min。然后将石蜡包埋,切片。石蜡切片完成后进行烤片、脱蜡、水化,用苏木精水溶液染色3 min,盐酸乙醇分化液分化15 s,稍加水洗,返蓝15 s,流水冲洗,伊红染色3 min,水洗,脱水,透明,封片,送镜检。

1.5.3胃组织中Akt1、FoxO3a、Beclin1、LC3-Ⅱ、p62 mRNA表达情况 取胃组织,加入TRIzol裂解液制备匀浆液,提取总RNA,加入38 μL RNase Free H2O(4 ℃预冷),冰盒上静置3～5 min,充分溶解RNA,于4 ℃下12 000 r/min离心1 min;将流出液再吸出,悬空打在吸附柱膜上,冰盒上静置3～5 min,于4 ℃下12 000 r/min离心1 min,将得到的RNA液保存在-80 ℃冰箱中,防止降解;利用紫外可见分光光度计测定RNA的浓度和纯度(OD260/OD280)。将mRNA通过mRNA反转录试剂盒合成cDNA,利用荧光PCR仪进行荧光定量PCR。反应体系:2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、RNase Free ddH2O 8.2 μL。反应步骤:预变性95 ℃,10 min;变性95 ℃,10 s;退火58 ℃,30 s;延伸72 ℃,30 s;40个循环。引物序列见表1,GAPDH作为内参,根据2-△△CT法计算相对表达量。

表1 Akt1、FoxO3a、Beclin1、LC3-Ⅱ、p62引物序列

1.5.4胃组织中Akt1、FoxO3a、LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表达情况 采用Western blot法检测:用液氮研磨仪对组织样本进行研磨,收集组织悬液,根据BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性,上样,进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)2 h,用300 mA恒流转膜80 min。一抗溶液4 ℃孵育过夜,二抗溶液中室温孵育2 h。在膜上滴加ECL发光液,在凝胶成像系统中曝光。采用ImageJ软件分析条带灰度值。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 正常组大鼠精神可,动作活动迅速,皮毛光泽,食量可,颗粒状大便,肛门比较干净,体重随着喂养时间的延长逐渐增加,未出现死亡。造模期间,模型组大鼠精神变差,动作行动迟钝,容易激惹,形体较瘦小,皮毛光泽度下降,容易脱毛,食量减少,大便呈糊状,肛门污秽,体重增加缓慢,有的甚至下降。叶酸组、黄芪-莪术组药物干预后,大鼠大便、精神、活力、食量相比模型组均有改善。实验结束前,模型组死亡2只,黄芪-莪术组、叶酸组各死亡1只。

2.2各组大鼠胃组织病理形态 正常组大鼠胃黏膜各层结构正常,固有层胃腺细胞排列整齐紧密、形态正常,未见出血、炎症细胞浸润等病变。模型组大鼠胃黏膜可见空腔融合,胃腺空泡化不规则,可见腺体增大,腺体间细胞增生,组织有少量炎症细胞浸润。黄芪-莪术组和叶酸组大鼠胃黏膜各层结构较为正常,偶见胃黏膜空腔融合,腺体细胞排列较为整齐紧密,组织未见出血、炎症细胞浸润等明显病变。见图1。

图1 正常组和胃癌前病变各组大鼠胃组织HE染色病理形态(×300)

2.3各组大鼠胃组织中Akt1、FoxO3a、Beclin1、LC3-Ⅱ、p62 mRNA表达情况 与正常组比较,模型组Akt1、p62 mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05),FoxO3a、Beclin1、LC3-ⅡmRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05);与模型组比较,黄芪-莪术组和叶酸组Akt1、p62 mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05),FoxO3a、Beclin1、LC3-ⅡmRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05)。见表2。

表2 正常组和胃癌前病变各组大鼠胃组织中Akt1、FoxO3a、Beclin1、LC3-Ⅱ、p62 mRNA相对表达量比较

2.4各组大鼠胃组织中Akt1、FoxO3a、LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表达情况 与正常组比较,模型组Akt1、LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),FoxO3a蛋白相对表达量明显降低(P<0.05);与模型组比较,黄芪-莪术组和叶酸组Akt1、LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),FoxO3a蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。见图2及表3。

图2 正常组和胃癌前病变各组大鼠胃组织中Akt1、FoxO3a、LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表达灰度图

表3 正常组和胃癌前病变各组大鼠胃组织中Akt1、FoxO3a、LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白相对表达量比较

3 讨 论

胃癌前病变是一个现代病理学概念,我国传统医学并无胃癌前病变病名,而是根据其症状将其归于“胃痞”“胃痛”等范畴。中医认为其病因主要有外邪犯胃、饮食饥饱失常、情志不畅、素体脾胃虚弱、药物损伤脾胃等因素,在临床常以本虚标实、虚实夹杂之证呈现。脾虚、气滞是该病基本病机,血瘀是该病的重要病机,在胃黏膜萎缩的发生发展甚至恶变中起关键作用[9]。总之,脾胃虚弱、胃络瘀血几乎贯穿胃癌前病变的始终。胃癌的发生遵循着正常胃黏膜→慢性浅表性胃炎→慢性萎缩性胃炎→肠上皮化生→非典型增生→原位癌→浸润癌的发生发展规律。

黄芪-莪术是一个经典的药对,黄芪味甘性微温,长于补气升阳,善补脾、肺之气,为补中益气之要药;莪术性辛苦温,具有破血行气、消积止痛之功。黄芪-莪术相配伍,一方面补脾胃之气以养后天之本,脾胃之气充则血行自畅,气旺则助莪术破血散瘀;另一方面黄芪甘缓之性可防莪术峻烈之性破血伤正。二者相互配合,补泻同施,动静结合。黄芪的主要药理成分包括多糖类、黄酮类和皂苷类,黄芪中的黄芪多糖和黄酮类具有抗肿瘤作用[10]。黄芪提取的活性成分可通过介导VEGF/MMP信号通路来抵抗血管的生成而起到抗肿瘤作用,还可以通过PI3K/Akt/mTOR信号通路起到抗肿瘤作用[11]。莪术根茎成分包括姜黄素类、挥发油以及酚酸类等物质[12],这些有效成分可以影响调节多条信号通路,起到抗炎、抑制细胞增殖、调节免疫、促凋亡等作用[13]。

Akt/FoxO3a信号通路是PI3K/Akt信号通路的一条下游信号通路,参与了细胞的增殖、分化、凋亡、自噬等过程。Akt有3种亚型,分别是Akt 1、Akt 2、和Akt 3,Akt 1的Ser473位点被Mtorc2磷酸化后,Akt酶活性也被完全激活,从而发挥相应的生物学作用,Akt可抑制促凋亡信号来调节存活周期,如Bad和FoxO转录因子。FoxO蛋白通过其独特的DNA结合域影响靶基因的转录,并受到了几种翻译后修饰调节,比如磷酸化、乙酰化和泛素化(34)[14]。FoxO激活靶基因的转录,促进细胞周期停滞、细胞死亡和细胞氧化应激,以维持代谢稳定。Akt可使FoxO转录因子磷酸化并失活,导致它们在细胞质中的核排斥和降解,从而触发细胞的异常存活,Akt还可下调 UVRAG 基因的表达起到抑制细胞自噬的目的[15]。

FoxO转录因子参与调节多种生物学过程,影响发育、新陈代谢、干细胞维持和寿命,能够调节细胞增殖、细胞死亡、血管的生成、细胞迁移和转移相关基因等,故被认为是肿瘤抑制因子。FoxO表达和功能的不足可能会促进遗传疾病、代谢性疾病、放松调控的衰老和癌症的发生[16]。FoxO3a是FoxO叉头转录因子亚家族的成员,参与细胞凋亡、细胞增殖等多种细胞过程,影响细胞的周期,与DNA损伤和肿瘤发生密切相关。在紫外线照射和氧化应激下,它可能会产生几种细胞应激反应[17]。FoxO3a与乳腺癌、肝癌、膀胱癌、鼻咽癌等多种癌症相关,其在癌症中起着肿瘤抑制因子的作用,其高表达能够抑制癌细胞的增殖、致瘤潜能和侵袭力[18]。

细胞自噬是维持体内细胞稳态的一种生物过程,Beclin1是一种重要的自噬调节因子,是酵母菌中 Atg6/VPS30 的同源物,能够参与自噬体膜的早期形成[18],此外还能参与自噬体的成熟。Beclin1与许多生物学过程如细胞分裂、肿瘤发生发展、细胞衰老死亡等有关[18],其高表达可作为体内自噬活跃的标志。相关研究表明,肿瘤的发生与转移的一个重要原因就是体内自噬系统的失常,Beclin1能够诱导肿瘤细胞自噬性死亡,从而产生一定的抑瘤效应[19]。LC3也是哺乳动物中一种常见的自噬标志物,在细胞中常以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ 两种形式存在,当体内自噬尚未发生时,LC3-Ⅰ在细胞内合成,自噬发生以后,LC3-Ⅰ经泛素化加工修饰后,与磷脂质PE形成LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ的表达越高,表明体内自噬越活跃[20]。杨勇明等[21]研究发现,胃癌组织中LC3阳性表达量明显低于癌旁组织。p62是一种中介蛋白,在多种细胞和组织中都有表达,能够参与多种信号的传导。p62可连接LC3和泛素化的底物,之后被整合到自噬体,随之被自噬溶酶体降解[22]。当自噬被激活时,自噬体与溶酶体融合,自噬体中的p62等蛋白或细胞器能够被溶酶体酶所降解,p62表达减少;当自噬被抑制时,自噬体积累,p62表达增加。

叶酸是生物合成体内核酸的必要物质,体内叶酸不足可以引起DNA甲基化异常和染色体断裂,从而增加癌变的风险。朱舜时等[23]发现补充叶酸后能增强体内基因的稳定性,抑制异常增殖,让萎缩的胃黏膜、肠上皮化生和异型增生不继续向胃癌转变,是临床中一种常用的胃癌二级预防药物。本研究以该药为对照,观察了黄芪-莪术药对逆转胃癌前病变的作用及机制,结果显示黄芪-莪术药对可以改善胃癌前病变大鼠的一般情况和胃黏膜病理改变,可明显下调Akt1、p62 mRNA表达和Akt1、LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表达,上调FoxO3a、Beclin1、LC3-ⅡmRNA表达和FoxO3a蛋白表达。提示黄芪-莪术药对可能通过影响Akt/FoxO3a信号通路、激活增强体内自噬而对胃癌前病变起到一定程度的逆转作用。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。