高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中的甲苯咪唑及其代谢物残留量

索纹纹，李小玲，刘伶俐，杨霄，万译文

（1.湖南省水产科学研究所，湖南长沙 410153；2.农业农村部渔业产品质量监督检验测试中心（长沙），湖南长沙 410153）

甲苯咪唑（Mebendazole，MBZ）又名甲苯哒唑、安乐士，属于苯并咪唑类的广谱杀虫剂，对防治动物体内寄生虫病有良好效果（胥宁等，2022 ；Ji 等，2020 ；Kulik 等，2011 ；Kim 等，1998），被广泛用于水产养殖业中。甲苯咪唑在动物体内的主要代谢产物是氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑。为了加强兽药残留监控，保证食品安全，我国在2019 年颁布的国家标准（GB 31650-2019 食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量）中规定甲苯咪唑在动物源性肌肉中最高残留限量为60μg/kg。

目前对甲苯咪唑及其代谢物检测多采用高效液相色谱法（朱珊珊等，2021 ；郭延萍和刘永玲，2021 ；于慧娟等，2010 ；姜朝军等，2009）和高效液相色谱-串联质谱法（温海滨等，2021 ；陈思敏等，2020 ；陈瑞等，2020 ；翟纹静等，2018 ；），这两种方法各有优势。高效液相色谱法成本低，在全国应用较广，对单个目标物的定量较为准确；高效液相色谱质谱联用仪有更高的灵敏度和选择性，抗干扰能力强，能获得更低检出限，定性能力强。本文建立了HPLC 与HPLC-MS/MS 法测定饲料中甲苯咪唑及其代谢物的分析方法，为政府部门对饲料中药物残留监控和质量安全评价提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 TSQ Quantum Access 高效液相色谱- 串联质谱仪；waters e2695 高效液相色谱仪；高速冷冻离心机；涡旋混匀仪；超声波清洗器；氮吹仪；精密电子天平。

甲酸、乙腈、乙酸乙酯、甲醇为色谱纯；磷酸二氢铵、三乙胺（分析纯）；DSPE EMR-Lipid 过滤柱；EMR polish 粉包。

甲酸/ 乙腈提取液：将甲酸与乙腈按5 ：95%（V/V）配置。溶解液：将乙腈和磷酸二氢铵以2 ：8 的比例充分混合。

甲苯咪唑及其代谢物标准品（纯度均＞97.1%）。使用时根据需要分别采用空白基质液同步前处理或直接经流动相配置成标准工作液，现配现用。

1.2 样品前处理

1.2.1 提取 准确称取饲料样品5.00 g（精确到0.02 g）至50 mL 具塞试管中，加入10 mL 甲酸/乙腈提取液，涡旋振荡混匀后采用超声提取10 min，于8000 r/min 离心5 min，将上清液转至20 mL的具塞带刻度管中，用10 mL 甲酸/ 乙腈提取液对残渣重复提取1 次，合并提取液定容至刻度，混匀备用。

1.2.2 净化 取5mL 上清液至EMR-Lipid dSPE管中并涡旋混匀5 min，另取50 mL 离心管，转入已经过EMR 净化后的上清液，加入EMR polish粉末包后涡旋混匀2 min，经6000 r/min 离心5 min。移取2 mL 上清液于10 mL 离心管中，于40℃氮气吹至近干。准确加入2.0 mL 溶解液，混匀后超声振荡1 min 溶解残渣，过0.45μm 滤膜，供HPLC 测定。当采用HPLC-MS/MS 测定时，残渣采用1 mL 的20% 乙腈水溶液溶解，混匀后过0.22μm 滤膜供上机测定。

1.3 仪器条件

1.3.1 高效液相色谱法 色谱柱为X-Bridgr C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；紫外检测波长为289 nm；柱温为40℃；流速为1.0 mL/min ；进样量为30μL；流动相A 为乙腈，B 为0.05 mol/L的磷酸二氢铵- 三乙胺溶液，采用梯度洗脱程序为：0 ～18 min，20% B ；18.01 ～20 min，40%B；20 ～20.1 min，40%～20% B；20.1 ～25 min，20% B 保持5 min。流速为200μL/min。

1.3.2 高效液相色谱串联质谱法

1.3.2.1 色谱条件 色谱柱为phenomenex kinetex C18 柱（100×2.1mm，2.6μm）；柱温为40℃。流动相A 为0.1% 甲酸溶液，B 为乙腈；采用液相梯度洗脱程序为：0 ～1 min，20% B ；1.1 ～4 min，20% B ～70% B ；4.1 ～8 min，70% B ；8.10 min，70% B ～20% B 保持2 min。进样量为10μL，流速为200μL/min。

1.3.2.2 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI）；选择反应监测模式（SRM）；正离子采集模式；喷雾电压为3500 V ；蒸发温度为300℃；离子传输管温度为350℃；鞘气压力为208 Pa，辅助气压力为104 Pa，碰撞气压力0.2 Pa。优化后的其他质谱采集参数见表1。

表1 甲苯咪唑及其代谢物的质谱分析参数

2 结果与讨论

2.1 提取液的选择与优化 由于甲苯咪唑及其代谢物难溶于水，所以文献中常用的提取溶剂有乙腈、甲醇、乙酸乙酯等。试验发现当饲料样品在碱性条件下采用乙酸乙酯进行提取时，样品不易分散，易黏结成团，提取效率较低。采用酸化乙腈可沉淀蛋白，减少对目标物的干扰。

2.2 净化方式的选择与优化 QuEChERS 法能快速高效的去除样品中的杂质，本文选用的EMR polish 粉包含有EMR 吸附剂，能有效去除饲料中的蛋白质、脂类、色素等杂质，可节约60% 试剂，减少前处理时间，提高了检测效率，也获得了较好的回收率。样品浓缩对比了旋蒸和氮吹两种方式。采用旋蒸时，旋蒸瓶中液体会发生鼓泡现象，造成待测物损失，且瓶壁上会残留油污，不易清洗。在40℃水浴条件下采用氮吹的方式进行浓缩，可获得良好的回收率和重现性。

2.3 色谱条件的选择与优化 在HPLC 法中，采用乙腈-0.025 mol/L 的乙酸铵溶液作为流动相，同时添加1 mL 三乙胺作为减尾剂，有利于目标物分离，使峰形更尖锐，对称性更好。HPLC 色谱图见图1。在HPLC-MS/MS 法中流动相均采用乙腈-0.1% 甲酸，各目标物在色谱柱上分离度高、峰形比较尖锐且噪音小，色谱图见下图2。

图1 甲苯咪咪及其代谢物的混合标准溶液色谱峰（1.0μg/mL）

图2 甲苯咪咪及其代谢物混合标准溶液的SRM 谱图（20μg/L）

2.4 方法线性范围 考虑到HPLC-MS/MS 检测基质效应的影响，由于同位素内标昂贵不易得到，本方法采用向空白样品添加不同浓度标准物质，同步前处理操作，获得含有基质干扰的标准曲线来定量，同时减少进样体积来消除基质效应，可获得满意的结果，见表2、表3。各目标物的浓度和色谱峰面积线性关系符合要求。

表2 高效液相色谱峰线性关系、检出限及定量限

表3 高效液相色谱串联质谱法峰线性关系、检出限及定量限

2.5 方法检出限与定量限 以3 倍和10 倍信噪比分别确定甲苯咪唑及代谢物的检出限（LOD）和定量限（LOQ），采取往空白样品中添加逐级稀释不同浓度的标准溶液按照本方法进行测定来确定信噪比，结果见表3 和表4。

表4 空白基质中HPLC 与HPLC-MS/MS 平均回收率及精密度（n=6）

2.6 方法回收率与精密度 方法回收率采用在空白基质样品中添加标准的方法来判定。目标物各添加3 种梯度的标准溶液，每个梯度6 个平行，按1.2 节所述条件进行加标回收率测定，分别用HPLC 和HPLC-MS/MS 法进行测定。回收率和相对标准偏差详见表4。结果表明，甲苯咪唑及其代谢物在HPLC 和HPLC-MS/MS 法测定的回收率（77.8%～112.1%）和精密度（3.09%～7.28%）满足要求，适合饲料中甲苯咪唑及其代谢物残留的测定。

3 小结

本文对提取液的选择、样品净化方式、浓缩方法及色谱条件等进行了优化，建立了饲料中甲苯咪唑及其代谢物的检测方法。通过方法学验证，该方法可准确监测饲料中甲苯咪唑及其代谢物残留量，为饲料中甲苯咪唑及其代谢物的风险监测、风险评估提供高效可靠的技术分析手段。