中药对急性热应激小白鼠肺、肾脏的热休克蛋白70及热休克因子1表达量的影响

段凯文，黄小红，李 莉，邓海英，江俊勇

（江西生物科技职业学院，江西南昌 330200）

热应激是环境温度超过等热区中舒适区的上限温度所致的应激反应，机体必须通过化学调节方式来减少产热，因而引起一系列的内分泌变化，严重影响动物的机能代谢和生产性能。热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是机体受到应激原刺激后产生的蛋白质，是生物热休克反应的主要标志；在其家族中，热休克蛋白70（HSP70）是最重要的一种蛋白质，具有分子伴侣作用，能帮助其他蛋白质进行正确的折叠、组装、转运，介导错误折叠的蛋白质进行降解（Eschmid，2012 ；Haslbeck，2002），同时还能提高细胞抗应激能力，增加细胞热耐受能力（Parcellier，2005）。因此，研究HSP 在热应激畜禽体内发生的动态变化以及如何利用HSP 保护动物机体抵抗热应激成为研究重点。本研究通过比较中药复方一、复二、复方三、紫锥菊与王老吉对急性热应激小鼠肺、肾脏组织HSP70 及HSF1 表达量的影响，探索中药复方防治热应激的作用机制，并探讨中药对HSP70表达调控机制，为抗急性热应激中药的研究与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验中药 复方一由藿香、香薷、生石膏、车前草等6 味中药组方；复方二由紫苏、薄荷、地胆草等6 味中药组方；复方三由生石膏、紫锥菊、藿香、紫苏等6 味中药组方，单方为紫锥菊。各种中草药各取30 g，加水300 mL 煎煮，沸后文火煮2 h，纱布过滤，滤液用旋转蒸发器浓缩到20 mL，使中药浓度为1.5g/mL。药液均经流通蒸汽灭菌30 min，4℃冰箱保存备用，共获得3 种复方中草药浓缩液和紫锥菊浓缩液。

1.2 主要试剂和仪器 热休克蛋白70 定量测定试剂盒与热休克因子1 定量测定试剂盒均购自美国RB 公司。王老吉购自奇康超市。主要仪器有Multiskan Mk3 酶标仪，DY89 Ⅱ型电动玻璃匀浆机，TGL-16B 型台式离心机，SP-01 型生化培养箱，分光光度计。

1.3 试验动物分组与处理 试验将90 只6 ～7周龄健康SPF 级昆明小白鼠随机分为复方一组、复方二组和复方三组、紫锥菊组、王老吉组、阳性空白对照组，阴性空白对照组，每组10 只。试验动物常规饲养，经1 周预试期后进入正式试验。试验1 ～5 组分别灌胃中药复方一、中药复方二、中药复方三、紫锥菊、王老吉，试验5 组只饲喂基础日粮。其中药物组和阳性对照组试验期间温度为40℃，相对湿度为60% ～80%、试验时间分为1 h、3 h。

1.4 样品采集与处理 在试验的第1、3 小时，每组取5 只小白鼠，剖杀取肺脏和肾脏，液氮速冻后于-20℃保存待测。称取肺脏和肾脏各0.2 g，剪碎（冰水浴中操作），加入组织块重量9 倍的匀浆介质（0.9% 冷生理盐水），用匀浆机3000 r/min 处理30 s，使细胞破碎后，3500 r/min 离心5 min，取上清液置于-20℃冰箱保存。

1.5 样品检测方法 HSP70ELISA 检测试剂盒测定肺脏和肾脏组织HSP70 表达量，HSF1ELISA检测试剂盒测定肺脏和肾脏组织HSF1 表达量，测试步聚按照试剂盒说明书完成。

1.6 数据统计与分析 试验数据采用SPSS

13.0 统计分析软件进行单因素方差分析，采用Duncan’s 法进行多重比较，结果用“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 对肺、肾脏HSP70 含量的影响

2.1.1 对肺脏HSP70 的含量影响 由表1 可知，在应激1 h 时，复方三HSP70 表达量极显著高于阴性对照组，略高于阳性对照组。复方一、复方二及王老吉组均略高于阴性对照组，但略低于阳性对照组。在应激3 h 时，复方一、复方二鸡和紫锥菊组HSP70 表达量较1 h 有所增加，而复方三，王老吉及阳性对照组均有所下降。其中复方一和复方二HSP70 表达量均极显著高于阳性对照组和阴性对照组，复方三极显著高于阳性对照组，紫锥菊和王老吉组均显著高于阳性对照组。其中复方二的作用最显著，可能是因为复方二中紫苏宣肺利气，发汗解表作用得到发挥。阳性对照组HSP70 表达量下降幅度最大。

表1 中药对急性热应激小鼠肺脏HSP70 含量的影响 ng/L

2.1.2 对肾脏HSP70 含量的影响 由表2 可知，热应激1 h 时，HSP70 的表达量比阴性对照组有所降低，而到3 h 时有所增加，普遍超过了阴性对照组。在应激3 h 时，复方一、复方二和复方三HSP70 的表达量均极显著高于阳性对照组和阴性对照组，紫锥菊组极显著高于阴性对照组，王老吉则显著高于阴性对照组。其中复方一的提升作用显著，这可能与车前草利水通淋，清热解毒作用关系密切。

表2 中药对急性热应激小鼠肾脏HSP70 含量的影响 ng/L

2.2 对肺、肾脏HSF1 含量的影响

2.2.1 对肺脏HSF1 含量的影响 由表3 可知，用药组在应激3 h 时HSF1 表达量均高于1 h 的。在应激1 h 时，各组HSF1 表达量的差异不显著（P＞0.05）。应激3 h 时，复方二极显著高于阴性对照组（P＜0.05），阳性对照组显著高于阴性对照组（P＜0.05）。

表3 中药对急性热应激小鼠肺脏HSF1 含量的影响 ng/L

2.2.2 对肾脏HSF1 的含量影响 由表4 可知，各组在3 h 时HSF1 表达量均低于应激1 h 时。在1 h 时，阳性对照组HSF1 的表达量最高，其次是王老吉组和复方三组。其中复方一、复方二和紫锥菊组极显著低于阳性对照组。在3 h 时，各组HSF1 表达量均有下降，但阳性对照组仍然高于其他各组。其中复方一和复方二极显著低于阳性对照组。

表4 中药对急性热应激小鼠肾脏HSF1 含量的影响 ng/L

3 讨论

3.1 对肺脏和肾脏Hsp70 含量的影响 肺肾之间存在相互滋生的关系，肺属金，肾属水，金能生水，肺阴下达于肾可滋养肾阴；肾阴为一身阴液之根本，故肾阴亦可上济于肺以滋养肺阴，这又叫“金水相生”。根据五行理论，肺金和肾水是母子关系。在生理功能中，肺和肾互相配合、互相影响，这就叫“肺肾相生”。在病理方面，肺气虚损可以导致肾气衰弱，即“母病及子”。相反，肾气衰弱也可以导致肺虚，则为“子病累母”。此病初起，由口鼻而入，肺先受之。湿热之邪由体表外感而入，由表入里，侵犯中焦，蕴脾生热，脾胃积热与湿交困，浸淫肌肤，或湿热久蕴于下，损伤肾气。本试验结果表明，在3 h 时，肺脏和肾脏的HSP70 表达量上升，且肾脏上升明显，Emami（1991）等研究发现，大鼠肾脏42℃ 15 min 热应激后HSP70 逐渐增加，4 ～6 h 达到高峰，与本试验结果相同。HSP70 可作为热应激的生物标志物（Kumar，2003），随热应激时间的增加，热应激对机体的影响由表及里，由上焦传至下焦。HSP70 表达的增强是细胞保护作用的体现，本试验数据表明，复方三和王老吉组HSP70 表达量不升反降，可知复方一和复方二的抗应激效果较复方三的效果好。

3.2 对肺、肾脏HSF1 含量的影响 HSF1 是基本结构蛋白，应激时通过可逆过程形成三聚体，与HSE 结合并激活HSP70 基因的转录。在非应激状态下，细胞质中HSP70 蛋白和HSF 结合形成HSF-HSP70 复合物，此时HSF 没有活性。当受到应激时，由于变性蛋白增多，与HSF 竞争结合HSP70，大量HSP70 与变性蛋白结合，导致HSF 从HSF-HSP70 复合物中释放出来，此时游离的HSF 在蛋白激酶或其他激酶的作用下发生磷酸化，形成有活性的三聚体，并转入核内（Pratt等，1997），在核内与热休克基因上游启动子区的HSE 序列结合，进一步被激酶磷酸化（Price，1992），然后启动热休克基因的表达。这一反应非常迅速，在受热后数分钟可达最高水平，约为应激前的10 ～20 倍。当HSP70 累积到一定程度时又与HSF 结合，HSF 和HSE 分离，抑制此转录过程，从而实现反馈抑制热休克反应。

本试验结果表明，中药能有效提高肺脏HSF1的表达量，但肾脏的HSF 表达量呈下降趋势，可能在应激3 h 时，肾脏HSP70 的含量升高到一定程度，与HSF 结合，反而抑制HSF1 的表达。

3.3 中药对热应激的治疗作用 夏季高温高湿产生的热应激在中医理论上属温热证范畴。暑湿是其中重要致病因素，《素问·至真要大论》中指出：“夫百病之生也，皆生于风寒暑湿燥火，以之化之变也。”暑性同火烈为阳邪，湿性重浊黏滞为阴邪。暑本炽盛，有得湿助，其热更炽；湿得暑蒸，其势更横。正如《湿热条辨》所说“夫热为天之气，湿为地之气，热得湿愈炽，湿得热愈横。湿热两分，其病轻而缓；湿热两合，其病重而速”。因此，用药上以清轻凉润、甘寒、咸寒为主，分别采用解表、清热、凉血、滋阴等方法（刘忠杰，2006）。武果桃等（2019）研究表明，复方中药可提高肉仔鸡机体细胞热耐受水平，提高生产性能。本试验3 个中药复方均以清热利湿为基本拟方原则，注重肺金养肾水这一治则，并有所侧重地筛选各种药物以组成方剂，如复方一中香薷行水消暑，藿香清理水道，车前草利水通淋。复方二中紫苏宣肺利气，发汗解表；薄荷性凉，疏散风热；陈皮行气导水；淡竹叶配伍诸药则清热利尿，复方三生石膏清实热，苍术燥湿，并加紫锥菊以增强机体免疫力。三组复方中，复方二能显著提高肺脏的HSP70 和HSF1 的含量，可能与组方中紫苏和薄荷的功效有关。费枫和刘锐（2023）研究表明，饲料添加薄荷提取物有助于提高热应激条件下断奶仔猪HSP70基因的表达量，与本试验结果一致。