绵羊精液液态保存中的应用现状

胡世超，于小杰，王 净

（1.河北北方学院动物科技学院 075000；河北省肉羊产业技术创新战略联盟 075000）

随着养羊产业的兴起，我国养羊业更加趋向集约化，与传统养殖业相比，规模化养殖有了显著的提升[1]。羊人工授精技术在现代养羊业中应用日益广泛。人工授精是在合理的时间范围内对家畜进行快速遗传改良最实用的技术，该技术具有提高优良公畜繁殖效率而减少公畜所需的头数，阻碍生殖道疾病传播，解决因公母畜体型差异大造成交配困难的难题，打破时间、地域限制实现配种等优点，羊人工授精的推广应用加速了遗传改良的进程[2]。

目前种公羊精液基本上是现采现用，保存期最长3 d 左右，不能满足生产需要，因此精液保存是人工授精最重要的一环，精液的保存方式有冷冻保存和低温、常温保存。冷冻保存适用于长时间保存精液，但冷冻保存成本高且绵羊精子耐冻性差易导致其活力和受精能力降低，保存在液氮中的冻精在转运时，由于道路颠簸，无法保证冻精的质量[3]。常温保存温度范围为15℃～25℃，操作简单、成本最低但保存时间短，不能实现远距离运输[4]。低温保存一般在0℃～5℃，与常温保存相比，精液的保存时间更长，能满足一定程度时间和距离的繁育要求；较冷冻保存而言，生产成本降低，又能有效提高精子的成活率[5,6]。目前影响绵羊精液保存的因素基本上是保存温度、精液稀释液成分、稀释倍数、渗透压等，以期延长精子保存时间和质量，提高母羊受胎率。

1 绵羊精液常温保存中的应用

常温下保存的精液，如果3h 内使用完成，则不需要特殊的降温处理，只需将精液密封放置在常温下即可，但是一般不能满足生产需要，需要进行处理使其保存时间更长。影响绵羊精液常温保存主要面临的问题有稀释液的渗透压和pH 值、微生物和活性氧（ROS）造成的损伤。精液稀释液一般包括能源物质、缓冲物质、抗菌物质、抗氧化物质等。

1.1 能源物质

能源物质主要为糖类，精液稀释液中常用的糖类包括葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、海藻糖等。有研究发现，糖类物质混合添加比单用某一种糖效果更好[7]。穆秀明等[8]研究发现，绵羊精液常温保存稀释液葡萄糖-蔗糖-柠檬酸钠比葡萄糖-乳糖-柠檬酸钠的效果要好，说明使用蔗糖的效果比乳糖好；徐振军等人在绒山羊精液常温保存的试验中得出稀释液含蔗糖效果更好[9]。张良斌等[10]对肉羊鲜精常温保存技术的研究中发现种公羊精液与稀释液1∶3 比例混合，海藻糖含量为2 g 时，精子活率在4 d 连续测试的活率高于其他含量浓度的活率，并且精子活率的降幅相对稳定，在第4 d 高于50%以上，也符合实际生产需要。

对能源物质进行改良和革新，是羊精液保存技术中的研究热点之一。卵黄也可作为能源物质，为精子的代谢提供能量，维持精子活性、保证精子膜以及保护顶体的完整性，张小刚等[11]提到稀释液中添加10%卵黄可为精子提供营养。卵黄为大分子非渗透性物质可以调节稀释液渗透压，使精子所处环境更加适宜。卵磷脂、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白(HDL)是卵黄中的主要物质，而卵磷脂和LDL 具有保护精子的作用。张柳明等[12]研究发现随精液保存时期变化，添加卵黄的浓度也应相应改变，可能是精液保存初期营养物质较为充足，而高浓度卵黄会改变精液浓度使渗透压发生改变，降低精子质量；精液保存后期营养物质消耗殆尽，需要高浓度卵黄为其提供充足营养。但在添加卵黄的同时还应承担相应的风险，因为卵黄是动物源性物质，可能存在未知的生物学感染，可能会有某种毒素等，也会因为饲养条件的不同、品种的不同，造成卵黄的性能不稳定[13]。

1.2 缓冲物质

缓冲液作用是调节并保持稀释液在精子所适宜的pH 范围内，绵羊精液pH 值约在6.7～6.8，当精子处于弱酸环境时代谢受到抑制能量消耗减少，所以稀释液pH 值等于或略小于精液pH 值会延长精子存活时间，但精子糖酵解过程中会产生大量酸性物质，pH 值骤降，精子受损，所以通常添加一些缓冲物如碳酸氢钠、柠檬酸钠、三羟基甲氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）等[14]。柠檬酸钠是目前广泛应用的缓冲剂，稀释液中加入3%的柠檬酸钠，可以保持羊精液pH 值的相对稳定。Tris 是生化实验中常用的缓冲剂，具有良好的缓冲能力和渗透性，毒性较低，一定程度上使精液pH 趋于碱性，维持精子活动，利于提高精子存活率。EDTA 可以用作螯合剂，与稀释液中Ca2+等有害重金属离子发生螯合反应，避免其与顶体结合，提高精子成活率[15,16]。

1.3 抗菌物质

由于采精器械未灭菌，未达到无菌操作标准，在精液采集和保存过程中，公畜精液可能会受到外源致病菌的污染[17]。所以加入适量的抗菌物质可抑制细菌的生长，降低有害细菌的存活率。传统使用的抗生素有青霉素、链霉素、双氢链霉素、硫酸庆大霉素、林可霉素等，在公羊精液稀释液中，加入青霉素和链霉素或庆大霉素可灭活布鲁氏菌和放线杆菌，使抗生素配伍使用效果更好。但随着细菌的耐药性逐渐增强，传统抗生素作用减弱，一些新型抗菌剂相继出现，主要是具有抗菌能力的肽类或蛋白质[18]。比如抗菌肽，绿原酸等物质逐步在稀释液中应用。还有HEL-75 蛋白，能够通过剂量依赖方式在精液保存中杀死大肠杆菌，而不影响精子的活力和受精能力。

1.4 抗氧化物质

绵羊精液具有抗氧化能力，精液保存时精子代谢可以产生活性氧，低浓度的活性氧可以提高精子透明带的结合能力，提高精子的活力。但当活性氧浓度高于精子抗氧化能力的最大值时，就会破坏核内DNA，破坏线粒体结构，缩短精子保存时间，使精子受精能力下降。精液中的死精子分泌芳香族氨基酸氧化酶，此酶可催化活性氧的生成，死精子越多，此酶浓度越大从而导致存活的精子受到损害，形成恶性循环。活性氧化物中的含氮化合物称为活性氮（RNS），也会对精子遗传物质和结构造成破坏，所以通常在精液稀释液中添加外源抗氧化物来阻碍氧化反应的发生、提高精子活性[19]。抗氧化剂有酶类抗氧化剂谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和还原型谷胱甘肽（GSH）等 ；非酶类抗氧化剂包括维生素类（维生素C、维生素E、维生素B12等）、激素类（多巴胺、褪黑素等）、氨基酸多肽类（牛磺酸、丙氨酸、半胱氨酸等）和多糖中的海带多糖以及多酚类中的茶多酚等[20]。

1.5 调节渗透压

渗透压是精子细胞膜内外存在压力差而产生的，在低渗或者高渗情况下都会使精子形态发生改变，如在高渗的情况下，精子大量脱水而皱缩死亡；在低渗条件下，精子尾巴膨胀，开始卷曲，出现质膜、顶体破裂等现象。有研究发现，常温保存的绵羊精液在渗透压较高的稀释液中，其精子活率和质膜完整率均优于低渗溶液[21]。稀释倍数也会对渗透压产生影响，要把精子密度稀释到最适合保存精子的状态，加入稀释液精子密度降低，增加精子游动空间，才能更好的吸收稀释液中的营养物质。在实践中常用到的稀释液是经过消毒的0.9%氯化钠溶液，但稀释倍数通常在2 倍以下[22]。有研究用葡萄糖-柠檬酸钠溶液将精液稀释3 倍，常温保存12 h 后，精子活力可达30%，仍具受精能力[23]。

2 绵羊精液低温保存中的应用

低温保存是在0℃～5℃环境中暂时抑制了精子的运动，使其代谢缓慢，且有效抑制了有害菌的生长繁殖。有实验表明，同一只杜泊羊，相同的稀释液和稀释倍数，在20℃～25℃下，8 h 后精子活率为0，而在低温保存下，72 h 后精子活率仍在80%以上，活力衰减5%以内[24]。费俊阳等[25]研究发现，选用萨福克和杜泊公羊精液采用专用稀释液处理并在0℃冰水混合物状态下保存，12 d 内精子活率在70%以上，顶体完整率保持在33%以上，满足生产需要。

2.1 低温保护剂

低温保存稀释液成分要比常温保存多一种低温保护剂，是因为公羊精子的敏感性很高，精子质膜磷脂中不饱和脂肪酸含量较多，通常我们认为只有在冷冻条件下才会使精子发生冷休克，实际上精子在10℃以下很容易受到低温影响而出现冷休克现象，因此，稀释液中要添加低温保护剂。通常实践中使用的保护剂是丙三醇（甘油），曹访等[26]在实验中得出，保护剂中乙二醇和丙三醇保护效果较好，其中以5%的丙三醇效果最佳，与孙时军等[27]在低温保护剂对4℃保存猪精液活率影响实验结果有些不同，孙时军等结果显示，乙二醇的保护效果优于丙三醇，可能是由于保护剂的添加量不同造成的偏差，也不排除动物个体间差异。保护剂用量不当会对精子活力和受精力存在毒害作用，丙三醇黏稠度高，容易影响精子活动，导致精子顶体出现异常，而乙二醇则会导致精子出现尾部畸形，保护剂添加量过多或过少都会对精子造成毒害。

动物源性物质如卵黄、奶类、蜂蜜也可作为精子低温保护剂。研究发现，卵黄是这些保护剂中效果较好的，因为卵黄中含有磷脂的脂蛋白对精子抵抗低温刺激效果显著，而且卵黄还可以提供能量[28]。有研究表明，添加卵黄稀释液在精子低温保存至第8 d 时，精子活率仍可达到输精标准且对精子DNA 伤害不大[29]。添加卵黄浓度很重要，当卵黄浓度过高超出一定范围时就会阻碍精子对糖类的利用，卵黄浓度一般在5%～20%，超出可能会影响受胎率。此外，卵黄为动物源性物质，可能会被细菌、病毒等污染，卵黄产生的芳香氨基酸会帮助死精子产生活性氧。目前，大豆卵磷脂为非动物源性物质可作为卵黄替代物之一。赵建清等[30]用1.25%浓度的大豆卵磷脂代替卵黄在低温下保存绵羊精液，延长了精子有效存活时间，并且比其他四组浓度（2.5%、3.5%、7.5%、10%）保存效果都好。而在添加低剂量大豆卵磷脂稀释液低温保存绵羊精液的研究中发现，添加0.5%浓度的大豆卵磷脂的效果更优[31]。另有研究发现，添加0.375%的大豆卵磷脂可以代替卵黄在绵羊精液低温保存中的作用，保存效果较好[32]。胡传水等[33]采用1.5%的大豆卵磷脂替代卵黄低温下保存猪精液，可以较好地维持精子活力和延长精子的有效保存时间。使大豆磷脂浓度差异的原因可能有：生产厂家的不同、不同批次的大豆磷脂效果不同、物种间的差异等。

2.2 其他物质

精子低温保存时，除了添加抗生素、营养物质、抗氧化剂等物质之外，还应该添加一些增强精子保护功能并且安全的物质，例如海藻糖、牛血清蛋白、褪黑激素、肝素等。

海藻糖属于非还原性双糖，是天然双糖中最稳定的一类，在高渗和低渗透压以及高温和低温等恶劣条件下，可在细胞表面形成保护膜，能有效地保护精子不受损害。邹宇银等[34]研究表明，在稀释液中加入少量海藻糖，不会直接提高精子活率，但明显提高精子顶体完整率，顶体完整率可间接反应精子功能，顶体中的顶体酶在受精过程中发挥关键作用。杨文瑾研究发现[35]，低温保存牛精液稀释液中加入一定范围浓度海藻糖时，海藻糖的浓度越高，精子活力越强，随着保存时间的延长，发挥的特性就越好。

牛血清白蛋白作为膜的稳定剂主要维持精子膜的稳定，可以阻止精子质膜黏连，也可帮助多数哺乳动物精子获能。王彦虎等[36]研究表明，在4℃条件下，添加3 g/L 牛血清白蛋白效果最佳，可提高湖羊精子质膜完整率、精子活率，但添加6 g/L牛血清白蛋白精液保存24 h 之后，会对精子有损伤。

哺乳动物精液在低温保存过程中易受到低温打击而发生损伤，精子损伤后会加剧活性氧的生成，活性氧过量就会造成质膜损伤、线粒体功能异常等。褪黑激素虽在绵羊精液保存中研究较少，但作为一种内源抗氧化剂，能够避免精子受到过氧化链式反应，保护细胞膜不受外界损伤。试验发现精子在低温保存下，加入褪黑素可显著提高精液保存效果[37]。肝素可用于牛羊等动物体外获能及顶体反应，稀释液中加入肝素，精子内钙离子含量明显增加，促进钙离子的吸收。

3 结语

精液保存技术和人工授精技术的应用有效提高了优秀种公畜的利用率，精液的保存研究会不断精进，精液稀释液中的抗氧化、抗菌、营养物质、维持渗透压及酸碱度等物质将日益更新。具有受精能力的精子在精液保存中才具有保存的价值和意义，但这些添加物在不定量情况下混合在一起，是否会影响精子正常的生理生化特性，是否会影响精子受精率以及某些表观遗传特性等问题仍处于探索阶段。