基于HS-SPME-GC-MS 技术分析不同种类黑茶香气成分

邓见田烨，晏美红，尚铂昊，李亦龙，肖 田，朱洺志,3,4, ，王坤波,3,4,

（1.湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南长沙 410128；2.湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南长沙 410128；3.湖南农业大学植物功能成分利用省部共建协同创新中心，湖南长沙 410128；4.湖南农业大学农业农村部园艺作物基因资源评价利用重点实验室，湖南长沙 410128）

黑茶是我国特有的后发酵茶，是中国最具特色的茶类之一[1-2]。近年来由于其降脂减肥、调节脂质代谢等多种健康益处而备受人们关注。随着黑茶中具有保健养生作用的功能成分被不断挖掘，黑茶已不仅限于边销或侨销，正在向外销市场扩张，出口东南亚、日本等地区[3-4]。黑茶产区广，可因特殊制作工艺与不同产地分成许多不同种类：茯砖茶、天尖、六堡茶、黑砖、藏茶等[5]。

由于原料、产地以及制作工艺等诸多因素影响，不同黑茶种类形成了各种独特的香气品质特征。天尖和六堡茶是篓装散茶的一类。天尖由特级、一级黑毛茶加工制得，通常带有松烟香[6]。六堡茶常以槟榔香和松烟香闻名[7-8]。茯砖茶和黑砖属于砖形紧压黑茶。茯砖茶砖块内布满冠突散囊菌，俗称“金花”，“发花”这一独特工序赋予茯砖茶独特的菌花香[9-10]。黑砖香气纯正带有松烟香[11]。藏茶主要产于四川省，由于畅销青藏高原地区而得名[12-13]。藏茶主要香气类型是陈香[14-15]。

目前针对茶叶香气成分提取的方法主要包括液-液萃取、减压蒸馏萃取、搅拌棒吸附萃取、水蒸气蒸馏法、同时蒸馏萃取法、超临界流体萃取法和固相微萃取法（Solid phase micro-extraction，SPME）等[16-17]。其中，固相微萃取中最常用的顶空固相微萃取（Headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）法操作简单，设备要求低，常用于提取挥发性、半挥发性有机物。该方法无需溶剂、集采样、萃取与浓缩为一体；同时，此方法对于热敏性成分提取较充分，且无有机试剂的干扰，香气还原度较好。因此，顶空固相微萃取（HS-SPME）法是提取茶叶香气成分较为常用的技术。

香气是决定茶叶品质最重要的关键因素之一，然而，目前关于黑茶香气的研究较多关注于单一产地或同种类间的比较，关于不同产地多种类黑茶间香气成分差异的相关报道较少。本文采用顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术对5 个不同种类黑茶样品进行香气成分检测分析，明确各不同种类黑茶香气成分组成差异，可为后期黑茶香气机理研究以及品质创新等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑茶 收于各地区，均使用锡箔袋密封保存于实验室4 ℃冰箱中；藏茶 产于四川省雅安市，2016 年；茯砖茶 产于湖南省益阳市，2016 年；天尖 产于湖南省益阳市，2016 年；黑砖 产于浙江省金华市，2016 年；六堡茶 产于广西省梧州市，2016年；56 种香气标准品 购于东京化成工业株式会社、美国Sigma、北京百灵威科技有限公司等。

7890B-7000C 气相色谱-串联质谱仪 美国Agilent 公司；75 μm CAR/PDMS SPME 固相微萃取手动进样手柄和萃取头 美国Supelco 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 感官审评 感官审评参照Li 等[18]的研究方法，审评人员由8 名专业人员组成。

1.2.2 固相微萃取法 精确称取1 g 磨碎茶样于15 mL 萃取小瓶中，加入转子，再加5 mL 100 ℃蒸馏水，在80 ℃恒温水浴条件下以转速600 r/min 萃取吸附60 min，GC-MS 解析10 min。

1.2.3 GC-MS 分析条件 GC 条件：色谱柱DB-WAX（30 m×250 μm×0.25 μm），进样口温度240 ℃，载气为氦气（纯度＞99.999%），柱流量为1 mL/min，分流比10∶1；升温程序为：35 ℃保持5 min，以2 ℃/min的速度升到100 ℃，保持1 min；再以5 ℃/min 的速度升温至240 ℃，保持2 min。MS 条件：离子源温度230 ℃，接口温度240 ℃，电离方式EI，电子能量70 eV，电子倍增器电压：1161 V，全扫描模式（Scan）下的质量扫描范围35～550 u。

1.2.4 定性定量方法 通过计算机检索与NIST05s.LIB 质谱库提供的标准质谱图进行对照，以匹配度大于80%为标准，根据保留指数计算公式，结合保留时间求出各被测组分的保留指数（Retention index，RI），保留指数计算公式[19]如公式（1）所示。通过文献以及数据库的保留指数进行鉴定；将待测物质的特征离子以及RI 与标准品比较进行定性。结合各色谱峰的峰面积进行香气相对含量分析，并根据检测出的各香气成分峰面积与内标（己酸乙酯）峰面积的比值进行相对定量。具体方法参照李永迪的研究方法[20]。

式中：RI 为待测物质保留指数；n 表示待测物质的碳数；RT（x）为待测物质的保留时间；RT（n）为待测物质流出前正构烷烃的保留时间；RT（n+1）为待测物质流出后正构烷烃的保留时间。

1.2.5 香气活性值（Odor activity value，OAV）计算OAV 为某香气成分的质量浓度与其气味阈值的比值[21-22]，OAV 计算公式如公式（2）所示。

式中：C 为香气成分的质量浓度，μg/L；OT 为该香气成分的气味阈值，μg/L。

1.3 数据处理

每组实验数据重复测定3 次。采用Excel 2019软件进行各样品香气成分的数据分析；采用Origin 2021 软件制作柱状图和雷达图；采用TBtools 软件制作热图；采用SIMCA-P 14.1 软件进行主成分分析（PCA）、层序聚类分析（HCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和计算预测变量重要性投影（VIP）；采用SPSS 27 数据处理软件（IBM）进行单因素方差分析（ANOVA）中的最小显著差异法检验，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同种类黑茶的感官审评结果分析

不同种类黑茶的感官审评结果如表1 所示，感官审评综合得分为藏茶（91.35）＞茯砖茶（90.15）＞黑砖（89.05）＞六堡茶（88.85）＞天尖（86.33）。五种黑茶在汤色、滋味以及叶底等方面的差异较小；藏茶、茯砖茶、黑砖的外形相对较好。根据感官审评结果（表1）中香气部分的审评结果，将不同种类黑茶的香气特征制成雷达图（图1），雷达图的数值表示黑茶样品的某一香气特征分值，分值越高表示黑茶样品的某一香气特征越明显。结果显示，不同种类黑茶的香气特征差异较大，藏茶具有持久的陈香，茯砖茶有明显的菌花香，稍带陈香，黑砖香气纯正，六堡茶具有明显持久的槟榔香与陈香，天尖具有持久的松烟香，所有茶样均稍带木香。

图1 黑茶感官审评雷达图Fig.1 Radar map of sensory evaluation of dark tea

表1 黑茶样品的感官审评结果Table 1 Results of sensory evaluation of dark tea products

2.2 不同种类黑茶的香气成分分析

为进一步分析不同种类黑茶产生不同香型的原因，利用HS-SPME-GC-MS 技术这5 个黑茶样品的香气成分及含量进行分析鉴定。由表2 可知，在五种黑茶中共检测到56 个香气成分。根据化合物主要官能团的不同将检测到的香气成分分为7 大类，其中，酮类化合物和醛类化合物最多，均为15 种，醇类化合物11 种，酯类化合物5 种，杂氧化合物5 种，碳氢化合物3 种及酚类化合物2 种。

表2 不同种类黑茶的香气成分定性分析与香气含量Table 2 Qualitative analysis and aroma content of different types of dark tea

续表2

结果显示，不同种类黑茶在香气成分的构成与含量上都有差异。五种黑茶样品的香气成分总含量排序为茯砖茶（6355.30 μg/L）＞藏茶（5858.73 μg/L）＞藏黑砖（5789.71 μg/L）＞藏天尖（4801.37 μg/L）＞藏六堡茶（3740.14 μg/L）。各样品的香气成分含量较多的种类为醛类化合物、酮类化合物、醇类化合物和酯类化合物。酮类化合物和醇类化合物多体现为花果香，醛类化合物多体现为青草香和花果香，这些化合物通常给予茶叶美好的香气[23]。茯砖茶中的醛类化合物、酮类化合物和醇类化合物的含量均为最高，茯砖茶的菌花香应与这三类化合物密切相关。在藏茶和茯砖茶中含量较高的1,2,3-三甲氧基苯和1,2,4-三甲氧基苯等杂氧化合物则会赋予茶叶陈香的香气品质。有些香气成分是某些种类黑茶特有的，如：柠檬醛I 在藏茶、茯砖茶和黑砖中检测出；3,4,5-三甲氧基甲苯和顺-茉莉酮在茯砖茶、六堡茶、藏茶和天尖中检测出；棕榈酸甲酯只在黑砖、六堡茶和天尖中检测出，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚只在茯砖茶中检测出。总之，由于不同种类黑茶的原料、加工工艺以及制作环境等因素的影响，不同种类黑茶的香气成分存在着较大差异。

不同香气成分在不同种类的黑茶间相对含量差异显著。由图2a 可知，五种黑茶的香气成分构成、化合物总数量和每类化合物间化合物数量差异不大，但由图2b 可知，不同种类黑茶间的香气成分相对含量差异显著，所有茶样中香气成分质量浓度较高的酯类化合物、醇类化合物、醛类化合物以及酮类化合物，总相对含量达到90%以上。藏茶、黑砖和天尖中香气成分质量浓度最高的是酯类化合物，分别含有2325.55、2628.10、2132.88 μg/L；占各样品香气成分总含量39.69%、45.39%、44.42%。茯砖茶和六堡茶中醇类化合物成分质量浓度最高，分别含有1939.81、1492.62 μg/L，其相对含量为30.52%和39.91%。藏茶、茯砖茶、黑砖、六堡茶、天尖中质量浓度含量最高的香气成分均为二氢猕猴桃内酯，质量浓度分别为2298.04、1290.95、2583.62、1299.50、2102.33 μg/L；占各样品香气成分总含量的39.22%、20.31%、44.62%、34.74%、43.79%。这些香气成分相互影响、共同作用形成黑茶特殊的香气品质。

图2 不同种类黑茶香气成分含量比较Fig.2 Comparison of aroma components in different types of dark tea

2.3 多组分化学计量学

OAV 是结合香气成分的含量和气味阈值，对各香气成分在样品的香气贡献进行综合评价的方法[24-26]。通常认为OAV＞1 的香气成分对茶叶香气形成有贡献，OAV＞10，则对茶叶香气形成有显著影响[27-28]。参照文献[20,23,25,29]中香气成分在水中的阈值计算出各香气成分的OAV，并记录文献所描述香气成分的香气特征。结果表明（表3），有31 种香气成分OAV＞1，即有31 种香气成分对黑茶的香气形成有贡献。这些香气成分类型主要为醛类化合物和醇类化合物。

表3 不同种类黑茶香气成分OAV 和香气描述Table 3 OAV and aroma attributes of aroma components in different types of dark tea

续表3

藏茶中，有27 种香气成分OAV＞1，其中OAV＞10 的香气成分有10 种，1,2,3-三甲氧基苯对藏茶香气具有突出贡献。茯砖茶中香气成分OAV＞1 的有30 种，其中OAV＞10 的有12 种，反,反-2,4-癸二烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、柠檬醛I、柠檬醛II 和正己醛等醛类化合物以及水杨酸甲酯对茯砖茶的菌花香具有突出贡献，而1,2,3-三甲氧基苯则对茯砖茶的陈香具有突出贡献。黑砖中香气成分OAV＞1 的有25种，其中OAV＞10 的香气成分有11 种，苯乙醇、橙花叔醇II 和氧化芳樟醇I 等香气成分的综合作用形成了黑砖纯正的香气。在六堡茶中有22 种香气成分OAV＞1，其中OAV＞10 的香气成分有9 种，（+）-雪松醇对六堡茶的槟榔香具有突出贡献。天尖中，香气成分OAV＞1 有25 种，其中OAV＞10 的香气成分有10 种，反,反-2,4-癸二烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛和正己醛等醛类化合物和植醇等醇类化合物对天尖的松烟香有突出贡献。这与黄林杰[8]、蒋容港[26]和张婷等[30]的研究结果相一致。综上所述，不同种类黑茶的特征香气形成的呈香香气成分均有所不同，同一香气成分对不同种类黑茶的香气形成也有不同贡献。

为研究不同种类黑茶中显著差异的香气成分，将五组茶样的56 种香气组分进行PCA，HCA 和PLS-DA 分析，并且结合OAV，研究不同种类黑茶中香气成分组成的差异及呈香香气成分的差异。PCA和HCA 分析表明（图3a、图3b），五种黑茶可明显分为5 组，表明5 组样品间香气成分组成具有显著差异。基于PCA 和HCA 结果，构建了PLS-DA 模型（图3c），拟合参数R2X=0.991、Q2=0.998，置换检验模型（图3d）R2=0.0507、Q2=-0.672，Q2回归线与纵轴的相交点小于零，表明该判别模型有较好的解释能力，且不存在过拟合现象，模型验证有效。

根据PLS-DA 模型，利用VIP＞1 且P＜0.05，共筛选出12 种差异香气成分，分别为反-2-己烯醛、反-2-壬烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、α-松油醇、橙花叔醇II、芳樟醇、顺式-3-己烯-1-醇、3,4-二甲氧基甲苯、2-正戊基呋喃、顺-茉莉酮以及4-仲丁基苯酚，将12 种差异香气成分含量制成热图（图4）。其中，有7 种差异香气成分OAV＞1，分别是：反-2-己烯醛、反-2-壬烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、橙花叔醇II、芳樟醇以及2-正戊基呋喃。

图4 差异香气成分热图Fig.4 Heatmap of the differential aroma components

3 结论

本研究采用感官审评对茯砖茶、黑砖、藏茶、六堡茶和天尖这五个不同种类黑茶进行综合评价。结果显示：藏茶具有持久的陈香，茯砖茶有明显的菌花香，带陈香，黑砖香气纯正，六堡茶具有明显持久的槟榔香与陈香，天尖具有持久的松烟香。

采用HS-SPME-GC-MS 技术对这五个不同种类黑茶的香气成分进行定性定量检测分析。结果表明，不同种类黑茶的香气成分在种类、数量以及相对含量均存在差异。五种黑茶中共检测出56 个香气成分。对数据进行OAV 分析并结合感官审评结果发现，具有陈香香气特征的1,2,3-三甲氧基苯对藏茶的陈香具有突出贡献，可能是藏茶的陈香最为突出持久的主要原因。反,反-2,4-癸二烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、柠檬醛I、柠檬醛II、正己醛和水杨酸甲酯对茯砖茶的菌花香具有突出贡献，而1,2,3-三甲氧基苯对茯砖茶的陈香具有突出贡献。反,反-2,4-癸二烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、正己醛和植醇等对天尖的松烟香有突出贡献。苯乙醇、橙花叔醇II 和氧化芳樟醇I 等香气成分综合作用形成了黑砖纯正的香气。这些香气成分相互作用、相互影响，共同形成了黑茶的特殊香气品质。基于VIP＞1 且P＜0.05，筛选出12 种含量差异达到显著水平的香气成分，结合OAV 值，在其中筛选出7 种差异性黑茶呈香香气成分，分别是：反-2-己烯醛、反-2-壬烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、橙花叔醇II、芳樟醇以及2-正戊基呋喃。

以上结果揭示了不同种类黑茶的风味特征及主要香气成分，为深入认识不同种类黑茶香气特征提供了数据参考。未来还可采用GC-O-MS、香气重组、智能感官等方法对各香气成分的协同作用进行深入研究。