肌肉蛋白质降解对发酵肉制品品质影响的研究进展

郑 云，郑 爽，周天硕，鲍 伟，韩 齐,2, ，李艳青,2,

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319；2.黑龙江省中加合作食品研究发展中心，黑龙江大庆 163319）

发酵肉制品是指在自然或人工条件下利用微生物的发酵作用，生成具有特殊风味、色泽和质地且保存期较长的肉制品[1]。蛋白质降解是肉制品发酵成熟过程中主要的生化变化之一，与发酵肉制品特殊风味和独特品质的形成均有显著相关性。目前，国内外研究者已对肉制品发酵过程中蛋白质和脂类氧化对风味变化影响研究有很多，但肌肉蛋白质的降解对品质的影响方面仍然存在欠缺。发酵肉制品肌肉蛋白质降解的主要过程为：蛋白质先经初步水解生成多肽，再通过肽酶不完全水解生成小肽，最后由各类肽酶水解生成更多的小肽和游离氨基酸[2]。

肉制品发酵过程中蛋白质的降解主要是经微生物产生的蛋白酶和内源酶的作用，部分转化为小分子物质，如氨基酸、酯、肽和挥发性物质，进而影响发酵肉制品的质地和风味。同时必需氨基酸含量的增加增强了产品的营养功能性[3-4]。发酵过程中，微生物群落是动态演变的，各个发酵阶段的菌群结构对品质的贡献也不同，部分微生物在发酵过程中呈现的作用对发酵肉制品的质量和理化性质有一定的影响[5]。多数研究者认为发酵肉制品的蛋白质降解是由微生物和内源酶共同作用的结果，但两者作用是否同时进行或分先后阶段，有无其他因素的影响等相关研究还未见报道，作用机制也尚不明确。本文综述了微生物对发酵肉制品品质的影响，包括从发酵肉中分离的微生物群落的种类，通过分析微生物作用，探讨发酵肉制品理化性质、蛋白质结构的变化及蛋白质降解对产品品质造成的影响，以期为近年来微生物调控蛋白质降解对发酵肉制品品质的特性研究提供思路。

1 肌肉内源酶对蛋白质的降解作用

为了阐明肉制品发酵过程中蛋白质的降解机制，国内外学者使用不同的模型系统进行研究，如在发酵香肠中添加微生物抑制剂（抗生素）或肌肉蛋白酶抑制剂。肌肉蛋白酶抑制剂的加入比微生物抑制剂（如抗生素等）更能保护肌球蛋白、肌动蛋白和肌钙蛋白T[6]。Verplaetse 等[7]的研究也证实了这一点，蛋白质的降解主要是通过内源蛋白酶来实现的，并且这类酶对西式发酵肉制品质构和风味的形成起重要作用。内源蛋白酶通过降解蛋白质和多肽从而释放小肽和氨基酸等，其具体可分为内肽酶和外肽酶。如图1a 所示，肉制品在发酵和成熟阶段，肌肉内肽酶（组织蛋白酶B、D、L 和钙蛋白酶）、外肽酶（氨基肽酶和羧肽酶）发生一系列生化反应，首先内肽酶将蛋白质分解生成多肽和许多低分子量化合物，然后生成的多肽被外肽酶进一步降解，最终释放出大量氨基酸及各类小肽，直接参与发酵肉制品质地和风味的形成[8-10]。

肌肉中内源蛋白酶的种类繁多，肌肉内肽酶是肉制品发酵初期肌原纤维蛋白和肌浆蛋白降解的主要因素[11]，因此组织蛋白酶和钙蛋白酶对发酵肉制品的特征风味和质地形成起主要作用。组织蛋白酶B、D、L 对肌肉蛋白质有着广泛的降解，引起干发酵香肠第一次蛋白质降解的主要内肽酶是溶酶体组织蛋白酶B 和D。然而，蛋白酶H 的作用尚不明确，钙蛋白酶对蛋白质降解的贡献较小，一般只能在鲜肉或肉制品成熟前期检测到，但它造成的损失会促进其他蛋白酶的降解[12]。具体见表1。

表1 发酵肉制品中肌肉内肽酶的类型和功能Table 1 Types and functions of intramuscular peptidase in fermented meat products

在肉制品发酵机制的研究中，多数集中于组织蛋白酶B 和D，根据内源性蛋白酶对肌肉蛋白质降解的作用位点进行分析（如图1b 和图1c 所示）：组织蛋白酶B 作用于肌动蛋白（actin）并产生大部分肽类，这些肽类是从蛋白质的N-端和C-端释放出来的，且多数为水溶性肽，肌动蛋白是肌肉组织中含量最丰富的蛋白质之一，因此其降解对发酵肉制品质地和风味的形成具有重要意义。组织蛋白酶D 的活性受温度影响较大，因此在适宜条件下组织蛋白酶D 能够广泛降解肌原纤维蛋白[8]。早期研究发现组织蛋白酶D 能够快速降解肌联蛋白（titin）、M 蛋白和C 蛋白，不能水解肌动蛋白[18]，但近期Hughes等[19]研究在适宜条件下组织蛋白酶D 可以从多位点对肌动蛋白进行降解。采用蛋白质组学方法对肌肉蛋白降解模式进行辅助分析，通过LC-MS 方法对发酵香肠模型中肌动蛋白降解产生的小肽进行鉴定，根据肌动蛋白序列和3D 结构显示，所鉴定的肽段覆盖了50%以上的肌动蛋白序列，并且4 个亚结构域的肽段都被得到鉴定，因此肌动蛋白发生了高度降解；并且还发现pH 较高时，发酵香肠中肌动蛋白降解率较低，可能是由于组织蛋白酶D 活性最适pH 较低[20]。Berardo 等[21]发现多肽的起点可以确定酶的切割位点，并且在干腌肉制品的加工过程中组织蛋白酶B 和D 可以保持活性较长时间，所以在发酵肉制品成熟后期多肽的数量仍然增加，同时产生游离氨基酸，一些游离氨基酸通过Strecker 降解产生挥发性物质。因此内源酶的活性与小肽的生成数量及发酵肉制品的感官特征高度相关，表明内源酶在发酵肉制品的特征风味形成过程中起着重要作用。

2 微生物蛋白酶对蛋白质的降解作用

发酵肉制品成熟期间，蛋白质经降解生成多肽、游离氨基酸等，一部分氨基酸随后脱羧、脱氨，进一步代谢成其他小分子化合物。现有研究普遍认为内源酶中组织蛋白酶对促进蛋白质降解发挥的作用更大[6-7]，但也有研究认为发酵肉制品中蛋白质的降解程度主要取决于肉质中的微生物菌群的种类和肉产品加工时的外部条件[22]。发酵过程的干燥脱水及盐的作用使产品水分活度降低，同时微生物通过消耗肌肉中的碳水化合物产酸，环境pH 降低，生成的酸性物质会促使盐溶性蛋白质变性形成凝胶结构，从而赋予发酵肉制品独特的口感。发酵菌株产生的蛋白酶同时加快了肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的降解，从而引起蛋白质结构改变，蛋白质结构一旦改变，蛋白质功能性质也发生变化，如疏水性基团、巯基暴露于分子表面，二级、三级结构发生改变，蛋白发生絮集，形成不可逆凝胶等；而降解产生的多肽、氨基酸、醛等化合物则参与了质地、风味的发展[23-24]。因此在发酵肉制品中研究微生物发酵剂对肌肉蛋白质的降解作用更具有实践意义，在发酵剂的筛选以及发酵工艺优化等方面具有指导作用。

目前，蛋白质组学技术在发酵肉制品的研究机制中也得到了广泛的应用，因此可通过蛋白质组学来研究微生物菌株对肌肉蛋白质的降解作用，从分子水平上探索优势菌株的作用机制。Luccia 等[25]将蛋白质组学技术应用于火腿发酵过程中所发生的蛋白质降解，研究了肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的降解情况，结果表明双向凝胶电泳图谱（2-DGE）比十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（SDS-PAGE）更能够详细的阐述蛋白质的变化。

2.1 乳酸菌

乳酸菌是一类革兰氏阳性细菌，主要包括乳球菌、乳杆菌、片球菌与链球菌等18 个菌属，在自然界中分布广泛，多数乳酸菌是公认的一般安全菌，可作为发酵剂和生物防腐剂使用，对食品的风味、质构和感官品质具有非常重要的作用，且由于具有很好的益生功能性，也是益生菌制剂较为常用的菌种之一[26-27]。通过比较各地发酵肉制品中的微生物群落，发现应用于发酵肉制品的乳酸菌属主要是乳酸乳杆菌和乳酸片球菌，这两类大量存在肉产品中，并且具有绝对优势[28]。

多数研究表明乳酸菌具有完善的蛋白质降解系统，发酵过程中乳酸菌可以产生各类肽酶降解蛋白质生成游离氨基酸；同时乳酸菌也可以通过代谢碳水化合物产生乳酸、乙酸、二乙酰等物质，降低发酵环境pH 提高蛋白酶的活性，从而直接或间接参与蛋白质降解，促进色泽风味的形成，抑制腐败菌和亚硝胺的生成[29]。孙雷等[30]分析了植物乳杆菌的全细胞悬浮液、细胞提取液及两者等比例混合物对肌肉蛋白质的降解情况，三种体系均引发了肌肉蛋白质的降解，其中两种酶原混合物所带来的积累效应增加了游离氨基酸的含量，同时乳酸菌蛋白酶渗入到肉制品中还增强了产酸率，说明乳酸菌的生长代谢也有助于肌肉蛋白质的降解。奇美等[31]选择了阿拉善高原具有很高经济价值的阿拉善双峰驼，通过SDS-PAGE 来评价乳酸菌对肌肉蛋白质的降解作用，驼肉经植物乳杆菌和戊糖片球菌发酵后，肌原纤维蛋白重链条带明显变浅，低分子质量条带加深，说明大分子蛋白进一步降解后部分小分子蛋白重新聚合或蛋白质变性聚集而成新的分子蛋白，赋予了发酵驼肉口感质地好、储存期间品质稳定等特性。

2.2 葡萄球菌

葡萄球菌是一种革兰氏阳性菌，在发酵过程中具有较强的脂肪分解能力，能生成蛋白酶将蛋白质分解为多肽和氨基酸，从而有利于人体吸收，进一步提高食品的营养价值。乳酸菌生成的蛋白酶大量消耗时，葡萄球菌对于保证产品的品质和风味是必不可少的。在发酵肉制品中葡萄球菌的多样性更加丰富，如木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌等，葡萄球菌在肉制品发酵过程中的动态变化也逐渐受到重视[32]。

葡萄球菌属在肉制品发酵过程中作为优势菌发挥重要作用，多数研究表明葡萄球菌对肌肉蛋白质有一定的降解作用，在各发酵时期对蛋白质的降解程度也不同。肌肉蛋白质经葡萄球菌降解后，呈味氨基酸在显著升高，葡萄球菌也可通过产生硝酸还原酶、过氧化氢酶等促进发色，其代谢产物（乳酸、醋酸及挥发性化合物）通过分解蛋白质和脂肪释放更多的香气物质，具有护色增香的功效，从而赋予发酵肉制品一定风味[33]。Majumdar 等[34]研究分析了印度东北部发酵鱼Sheedal，从中分离鉴定得到7 株凝固酶阴性葡萄球菌均表现出较强的蛋白质降解活性，并且在蛋白质降解过程中释放出芳香族化合物和有机酸等，促进了发酵食品的质地和风味。此外，有研究证实了发酵菌株对肉制品中肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的降解能力存在差异，田媛等[35]研究发现葡萄球菌对发酵肉制品肌原纤维蛋白无明显降解效果，而对肌浆蛋白有一定降解能力，并且改善了肉制品的色泽和代谢过程。而Villani[36]和Fadda 等[37]研究表明，乳酸菌对发酵肉制品肌原纤维蛋白的降解能力不如肌浆蛋白的降解能力强，主要改善了肉制品的质地、嫩度。这可能是发酵菌株本身的菌种特异性导致的，且发酵原料和发酵环境不同也会导致发酵菌株代谢途径的差异。

2.3 酵母菌

葡萄糖在厌氧条件下可以分解成二氧化碳和酒精，产生的酒精与酸相互作用，生成具有酯类等化合物，使发酵产物的香气更温和、更浓郁。因此酵母菌可以促进发酵肉制品的呈色、改善风味、抑制腐败菌[38]。

酵母菌是发酵肉制品中常见的微生物，具有一定的蛋白酶活性和脂肪酶活性，对酸性环境耐受能力较强，具有很强的产香能力，可降解肌原纤维蛋白和肌浆蛋白，能够抑制脂类氧化，延缓酸败以及产生酮类、醇类等重要风味物质，对发酵肉制品风味产生重要贡献[39]。发酵肉制品中最常见的酵母菌是汉逊德巴利酵母菌。Cano 等[40]分析了慢发酵香肠中接种汉逊德巴利酵母菌，发现这种菌株在降解肌肉蛋白质过程中能够产生酯类化合物，对于丰富发酵产品的风味起到重要意义。此外，酵母菌可以与乳酸菌配比成混合发酵剂，不仅可以改善产品风味和颜色，还可以延长产品的保质期。王鹤霖等[41]研究了植物乳杆菌和鲁氏酵母菌混合发酵剂对发酵香肠品质的影响，从结果可看出混合发酵剂可以显著促进发酵香肠的蛋白质降解，改善产品的色泽，延缓脂肪氧化，促进发酵风味的形成。Zeng 等[42]研究分析了从传统低盐发酵酸鱼中分离得到的25 株酵母菌，发现7 株酵母菌具有良好的蛋白质降解活性，从而赋予发酵鱼肉一定的风味。因此，无论酵母菌是单独存在还是与乳酸菌等结合存在，都会对发酵产品的口感、香气、质地和营养价值起到促进作用。

2.4 其它菌属

霉菌是一种可在发酵产品表面形成保护膜的好氧型真菌。大部分霉菌可通过氧化还原作用使发酵产品形成良好的色泽，霉菌产生的各种酶类对发酵香肠持有特殊香气和风味也起主要作用。发酵肉制品中部分采用的是红曲霉和青霉菌，陈肖等[43]研究发现红曲霉在发酵红曲米时产生的水解酶类可以赋予肉制品悦人的色泽。Trigueros 等[44]研究了干腌香肠表面的霉菌，发现肉制品发酵过程中霉菌具有较好的蛋白质降解能力，增强了肉制品的感官特性。发酵肉制品中芽孢杆菌也具有较好的蛋白质降解活性，有研究表明富含蛋白质的食物主要受芽孢杆菌的影响，肉制品在发酵中后期随着pH 和耗氧量的降低，微生物种类逐渐减少，但芽孢杆菌可以生长并逐渐成为优势菌群[45]。具体见表2。

表2 核心微生物群落对蛋白质降解的研究Table 2 Studies on protein degradation by core microbiome

3 蛋白质过度降解导致发酵肉制品品质的劣变

肉制品的发酵是蛋白质结构和功能特性发生变化的一个过程，任何改变蛋白质溶解度的因素都必然会影响发酵肉类的品质，而肉制品的质地直接影响消费者的购买决策[57]。在肉制品生产或发酵过程中，蛋白质降解产生多肽、氨基酸等，部分氨基酸进一步代谢，产生的物质对发酵肉制品风味和质地做出重要贡献，蛋白质的凝胶化与其构象密切相关，蛋白质过度降解（发酵时间过长，微生物数量控制不当）易诱导特定氨基酸和肽的生成，产生高浓度的低分子量含氮化合物，甚至产生苦味、金属味和酸败味，严重影响发酵肉制品风味；也会发生蛋白质交联和聚集，不利于凝胶结构的形成，从而加速产品品质的劣变，降低产品感官特性，失去食用价值。如自然发酵鱼肉制品中的微生物常常由于粗糙的加工方式使发酵菌群更加复杂，腐败微生物的生长不能得到有效控制，而腐败微生物引起的蛋白质过度降解与鱼肉产品质量的下降高度相关[58]。

SDS-PAGE 技术被广泛应用于鉴别蛋白质的变化，SDS-PAGE 图谱中大分子质量蛋白条带的增加、模糊、弱化、消失和低分子质量条带的出现、浓度增强是蛋白质发生降解的外在表现，新条带的不断出现也可能是发酵肉制品腐败的重要标志[59]。刘寿春等[60]研究中，鱼肉发酵前期肌原纤维蛋白各条带明亮清晰，随着时间的延长200～29 kDa 之间的条带逐步出现不同程度的降解，其中肌球蛋白重链200 和29 kDa 附近出现条带高度降解并伴有条带缺失，肌动蛋白45 kDa 处无明显变化。17 d 后，开始出现较强烈的蛋白降解，伴有低分子质量的条带生成，低分子质量条带浓度和亮度逐渐增强。相比之下，肌浆蛋白与肌原纤维蛋白的构成不同，主要表现在200～66 kDa 和小于45 kDa 处的条带明显降解，从而判断鱼肉可能发生了劣变。韦诚[61]分析了酸肉发酵过程中蛋白质的降解情况，通过考察结构特性发现，肌原纤维蛋白和肌浆蛋白发生降解，蛋白质氧化变性程度加深，疏水性、二硫键含量显著增加，导致蛋白发生交联，进而导致酸肉品质劣变。SDS-PAGE 结果表明肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的条带数量持续减少，色泽变浅，特别是发酵110 d 后可观察到，出现宽而深的蛋白条带，可能是肌肉蛋白质逐步水解、部分小分子蛋白质重新聚集形成的大分子蛋白质有关。肌肉微观结构也表明随着发酵时间的延长，蛋白质过度降解导致肌束膜被破坏，部分肌纤维束发生塌陷，促使其彼此粘连，导致肌肉横截面纹理不规则，营养成分流失，说明了过度降解导致酸肉品质发生了劣变。

蛋白质降解也受肌肉部位、蛋白质种类、pH 及其他多种因素影响，这些加工条件均会显著引起蛋白质降解速率的变化。温度和盐浓度是发酵肉制品加工中最重要的加工条件之一，适宜的发酵温度可使微生物蛋白酶活性增强，促进蛋白质降解，加速肌肉结构的崩解和风味物质的形成。而发酵温度过高，导致微生物产酸特性增强，肌原纤维蛋白含量减低，剪切力增加，嫩度下降，咀嚼性较差，影响产品整体的感官评分[62]。盐浓度不仅可以使食品具有适度的咸味，还有助于增加保水性和色泽鲜亮，能够使产品形成良好的凝胶质地和感官品质。研究发现降低肉中NaCl含量或扩散的速度都会导致蛋白质急剧降解，品质发生劣变，进而对发酵肉制品的品质和风味产生一定影响[63]。肉制品发酵过程中NaCl 的减少和生火腿pH 的变化使内源性蛋白酶活性增强，促进肌肉蛋白质剧烈降解，导致发酵肉制品形成过度粘附性和引发苦味。因此，国内外研究者采用包括超高压和超声波在内的新兴技术着手改善发酵肉制品的口感特性和质地特征。采用温和加热和超高压相结合的方法，提高了发酵肉制品的硬度、降低了粘附性，但由于成本较高、费力耗时，通常不投入大规模应用。一些研究表明，超声波处理可以有效提高发酵肉制品中结构蛋白的降解，改善产品的质地和风味[64]。Lopez 等[65]使用超声波来监测肉制品发酵过程中蛋白质降解强度，结果表明超声波处理显著增加了肌球蛋白、肌动蛋白和肌浆蛋白片段。Zhou 等[66]研究了超声波处理对干腌火腿蛋白质降解的影响，从结果可看出在功率1000 W，温度50 ℃时，超声波处理能够显著促进肌肉蛋白质的降解，释放甜味和鲜味氨基酸，有效减少了干腌火腿的苦味，提升产品的风味。

4 结语和展望

在发酵过程中，肌肉蛋白质降解作用是发酵肉制品特殊质地和风味形成的一个重要途径。肌肉蛋白质的降解与内源性蛋白酶和微生物的降解作用密切相关。本文重点阐述了核心微生物的研究现状、内源酶和微生物蛋白酶对肌肉蛋白质的降解作用。具有风味和品质改善作用的肉制品发酵菌株的应用也为改善工业化发酵肉制品的风味缺陷提供了有效手段，对发酵肉制品的发展具有深远意义。但是在发酵肉制品的研究中也存在一些问题，主要体现在3 方面：a.对于发酵过程中蛋白质的变化，大部分研究的焦点集中在定性判断和定量层面，很少关注其自身微观结构的变化；b.发酵过程中，微生物和内源酶的相互作用机制不明确；c.肌肉蛋白质降解程度需有效手段加以控制。此外，特定的优势微生物可能在发酵机制中发挥重要作用，利用现代基因工程优化发酵微生物的功能，如通过蛋白质组学技术研究调控基因功能性，建立基因组序列和其生物学作用之间的桥梁，也可以为筛选具有良好适应性的菌株以及生产高质量的发酵产品提供理论基础。