海洋细菌Sphingomonas sp. Q2 产琼胶酶发酵条件优化、酶学性质及降解产物研究

钱洗谦，乔乐克，张洪锋，江晓路，王 鹏，张京良,,

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003；2.青岛海洋生物医药研究院，山东青岛 266100；3.青岛海莱美生物科技有限公司，山东青岛 266400；4.中国海洋大学医药学院，山东青岛 266003）

琼胶酶是一类可以催化琼胶降解形成琼胶寡糖的糖苷水解酶，分为α-琼胶酶和β-琼胶酶两类[1]，α-琼胶酶作用于琼脂糖的α-1,3 糖苷键，产生以3,6-内醚-α-L-半乳糖为还原端的琼寡糖（Agarooligosaccharides，AOS）；β-琼胶酶作用于β-1,4 糖苷键，产生以β-D-半乳糖为还原端的新琼寡糖（Neoagarooligosaccharides，NAOS）[2]。在食品医药化工领域琼胶酶可高效降解琼胶制备具有抑制淀粉老化[3]、防腐[4]、抗氧化[5]、保湿[6]、美白[7]、抗炎[8]、益生元[9]多种生理活性的琼胶寡糖。此外，琼胶酶还可用于分离海藻单细胞和制备海藻原生质体，以及从琼胶糖中回收DNA 和RNA[10]等。

琼胶酶产生菌主要来源于海洋环境，目前报道的琼胶酶产生菌主要包括：假单胞菌属（Pseudomonas）[11]、弧菌属（Vibrio）[12]、链霉菌属（Streptomyces）[13]、交替单胞菌属（Alteromonas）[14]、不动杆菌属（Acinetobacter）[15]等。由于海洋环境的特殊性，菌株在产琼胶酶时存在酶活力不高且产酶条件不稳定等问题[10]，限制琼胶酶开发应用。因此，筛选获得新型产酶菌株并通过发酵优化改良其产酶能力，对于琼胶酶研究应用具有重要意义。由于琼胶降解菌大多是海洋菌，所产琼胶酶的最适pH 多偏弱碱性且耐热性较差，不利于高温下酶促反应的进行。目前对产琼胶酶菌株的研究多集中在假单胞菌、弧菌等菌株上，而对鞘氨醇杆菌的研究较少且缺乏对其酶学性质及降解产物的研究，限制了鞘氨醇杆菌在产琼胶酶研究中的进一步应用。

随着人们对健康生活需求的提升，酶法水解琼脂得到的琼胶寡糖需求量不断增长，其广泛应用于食品、药品、保健品中，因此，开发一种产酶能力强且稳定性高的新型琼胶酶尤为重要。本文从江蓠中筛选获得一株新型产琼胶酶鞘氨醇菌株Sphingomonassp. Q2，对Sphingomonassp. Q2 菌株发酵产琼胶酶的培养基组成进行优化，提高其产酶能力。通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶层析技术对Sphingomonassp. Q2 琼胶酶进行纯化，并对其酶学性质及降解产物进行研究，为琼胶寡糖的高效制备提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鞘氨醇杆菌Sphingomonassp. Q2 本实验室分离保存；种子培养基（w/v） 琼脂2 g，氯化铵1 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5 g，氯化钠15 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0；发酵基础培养基同种子培养基；琼脂、NaCl、K2HPO4、（NH4）2SO4、NH4Cl、十二烷基硫酸钠等分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

ZWY-2102C 型全温摇床 上海智城分析仪器制造有限公司；CF1524R 型台式高速冷冻离心机美国赛洛捷克公司；HWS24 型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；UV-6000PC 紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 琼胶酶活力测定 采用3,5-二硝基水杨酸法测定酶活力[16]。操作步骤如下：用0.05 mol/L、pH7.0的柠檬酸缓冲液配制浓度为0.2%的琼胶溶液，向1.9 mL 琼胶溶液中加入0.1 mL 酶液，40 ℃反应30 min，加入2 mL DNS，沸水浴中加热5 min 显色，迅速冷却，用蒸馏水定容至25 mL 并摇匀，于520 nm处测定吸光值，用灭活酶液作空白对照。以D-半乳糖绘制标准曲线计算酶活力。

酶活力单位（U）定义为在实验条件下，每分钟催化底物产生1 μg 还原糖所需的酶量。发酵液酶活力单位定义为每毫升发酵液含酶活单位（U/mL）。

以Bradford 法[17]测定蛋白含量，采用牛血清白蛋白为标准蛋白。

1.2.2 发酵培养优化 前期Plackett-Burman 试验与最陡爬坡实验结果表明琼脂、磷酸氢二钾、氯化钠对酶活力影响较大（另文发表），因此通过Box-Behnken实验设计三因素三水平实验（表1），以琼脂、磷酸氢二钾、氯化钠为影响因素，琼胶酶活力为响应值，建立响应面回归模型，确定最优培养基及各组分的交互作用。

表1 Box-Behnken 试验设计因素与水平Table 1 Experimental design factors and level of Box-Behnken

1.2.3 琼胶酶的分离纯化

1.2.3.1 硫酸铵分级沉淀 发酵上清液加入硫酸铵至0%～90%饱和度，4 ℃静置过夜，8000 r/min 冷冻离心20 min，收集沉淀及上清液，测定不同饱和度下的琼胶酶活力和蛋白质含量，由此确定硫酸铵沉淀的最佳饱和度。

1.2.3.2 QFF 阴离子交换层析 将所得粗酶液进行透析脱盐并经0.22 μm 滤膜过滤后上样于QFF 阴离子交换柱，用0～1 mol/L NaCl 溶液梯度洗脱，洗脱液经紫外吸收检测并进行收集（2 mL/管）。检测波长为280 nm，测定有紫外吸收峰试管中的洗脱液酶活力。

1.2.3.3 Sephdex G75 凝胶柱层析 将1.2.3.2 中得到的酶液上样于Sephdex G75 凝胶柱，用pH7.0 Tris-HCl 缓冲液进行洗脱，流速控制为0.2 mL/min，洗脱液经紫外吸收检测并进行收集（2 mL/管），测定有紫外吸收峰试管中的洗脱液酶活力。

1.2.3.4 SDS-PAGE SDS-PAGE 凝胶电泳由12%的分离胶和8%的浓缩胶组成，蛋白质的染色与脱色均采用常规考马斯亮蓝染色法和脱色技术[18]。

1.2.4 酶学性质

1.2.4.1 酶的最适温度及温度稳定性 分别在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃温度下测定酶活力，以最高酶活力为100%，考察酶的最适反应温度。将酶液分别在不同温度下保温8 h，测定其对应的剩余酶活力，以未处理的酶活力为100%，考察酶的温度稳定性。

1.2.4.2 酶的最适pH 及pH 稳定性 分别用50 mmol/L pH 为3.0～5.0 的柠檬酸盐缓冲液，50 mmol/L pH 为6.0～8.0 的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液和50 mmol/L pH 为9.0～10.0 的甘氨酸-NaOH 缓冲液，将酶液分别置于以上不同pH 的底物缓冲液中测定琼胶酶的活力，以最高酶活为100%，研究酶的最适pH。将酶液在最适pH 下40 ℃放置6 h，测定酶的剩余活力，以未处理的酶活力为100%，研究酶的pH 稳定性。

1.2.4.3 不同金属离子对酶活力的影响 向酶液中分别加入终浓度为50 mmol/L 的不同金属离子，室温下放置1 h，测定剩余酶活力，以未添加金属离子的酶活力为100%，考察金属离子对酶活力的影响。

1.2.4.4 动力学参数测定 将酶液与不同浓度的琼脂作用，测定酶反应的初速度，用Lineweaver-Burk双倒数作图法求出以琼脂为底物的酶的Km值。

1.2.5 降解产物分析 将纯化后的酶液添加到含0.2%琼脂糖的50 mmol/L 酸盐缓冲液（pH7），在40 ℃下，反应2 h，沸水浴10 min 终止反应，8000 r/min冷冻离心10 min，收集上清液在安捷伦6460 三重四极质谱仪上进行负离子电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析，进样量10 μL，流动相为乙腈:水（1:1）。用重水处理降解样品并反复冷冻干燥三次，样品最终用重水溶解，利用安捷伦DD2-500 光谱仪记录13C-NMR光谱。

1.3 数据处理

每个实验设置3 组重复，且实验数据为3 次平行试验的平均值。使用Origin 2021 及Expert 8.0.6软件对实验数据及图片进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 发酵培养条件优化

采用Box-Behnken 试验设计响应面试验，以琼胶酶活力为响应值，结果见表2。用Design Expert 8.0.6 软件对表2 中数据进行多元回归拟合，得到的回归方程为Y=1078.94-7.91A+107.85B-68.13C+91.58AB-11.03AC+50.57BC-61.44A2-138.12B2-35.51C2，并对回归模型进行方差分析，结果见表3。由表3 可知，回归模型的P＜0.0001，极显著；失拟项P＞0.05，不显著，说明模型可靠，决定系数R2=0.9988，校正决定系数R2adj=0.9973，CV%=0.72%。通过方程可以看出琼胶酶活性与3 个因素呈线性关系，该模型拟合性较好，可以用该模型来分析和预测琼脂粉、磷酸氢二钾、氯化钠对菌株产琼胶酶活力的影响。

表2 Box-Behnken 试验设计与结果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用软件Design Expert 8.0.6 根据二次回归方程作出响应面及等高线如图1 所示。图中响应面坡度越陡峭表示该因素对菌株产酶活力影响越大。等高线形状可以直观反映交互作用的强弱，椭圆形为交互作用显著，圆形则为不显著，由图1 和表3 分析可知，琼脂和磷酸氢二钾、磷酸氢二钾和氯化钠对酶活力影响的P＜0.0001，说明交互作用极显著，琼脂与氯化钠的P＜0.05，交互作用较显著。当琼脂浓度为4 g/L 时，琼胶酶活力随着磷酸氢二钾浓度的增加而升高，当磷酸氢二钾浓度达到1.30 g/L 时，琼胶酶活力升高至最优值，随着两个变量增加，酶活力呈先上升后下降趋势，而琼脂对菌株产酶活力影响较小。

图1 不同因素交互作用的响应面曲线图Fig.1 Response surface plots for the cross-interaction of different factors

通过上述二次多项回归模型，利用软件Design-Expert 8.0.6 优化培养基组成，获得最优发酵培养基：琼脂4.42 g/L、氯化钠10.51 g/L、磷酸氢二钾1.30 g/L。此最优发酵培养基中的酶活力预测值为1107.40 U/mL，对上述条件进行验证实验，最终得到的琼胶酶活力为1085.71 U/mL，与预测值接近，说明优化后的回归方程对预测菌株的产酶活力具有可靠性。与目前已报道的产琼胶酶海洋细菌多食鞘氨醇杆菌（酶活力18.40 U/mL）[19]和弧菌（酶活力51.60 U/mL）[12]相比，本研究菌株Sphingomonassp.Q2 产琼胶酶活力较高。

2.2 琼胶酶的分离纯化

2.2.1 硫酸铵沉淀结果 硫酸铵沉淀法可从粗酶液中浓缩和纯化蛋白质，且不易使蛋白质变性[1]。不同硫酸铵饱和度下沉淀物及上清液中的相对酶活如图2 所示。结果显示，随着硫酸铵饱和度的增加，沉淀物的酶活逐渐增加。当硫酸铵饱和度为60%时沉淀中的酶活力接近最大值，且上清液中几乎检测不到酶活力，故在后续步骤中，选择饱和度为60%的硫酸铵进行琼胶酶粗分离。

图2 不同硫酸铵饱和度对琼胶酶活力的影响Fig.2 Effects of different ammonium sulfate saturation on agarase activity

2.2.2 柱层析纯化 洗脱液紫外吸收及酶活力测定结果如图3 所示，洗脱梯度为：0～14 min，0% B；14～34 min，0～100% B；34～45 min，100% B。对两个洗脱峰的酶活力进行测定，结果显示主要酶活力集中在第二个峰中，因此，收集第二个峰的洗脱液进行透析除盐并进一步用凝胶层析柱进行纯化，结果如图4所示，在280 nm 条件下检测到一个峰，经酶活检测结果表明该峰为活性集中部分，因此，收集洗脱液进行纯度和分子量检测。

图3 QFF 阴离子交换层析图Fig.3 Elution profile of agarase on QFF column

图4 Sephdex G75 凝胶过滤层析图Fig.4 Elution profile of agarase on Sephadex G75 colmun

2.2.3 琼胶酶纯化结果分析 琼胶酶的分离纯化结果如表4 所示，经硫酸铵沉淀、QFF 阴离子交换层析、Sephdex G75 凝胶柱层析后，琼胶酶的比活为112048.82 U/mg，纯化倍数为7 倍，回收率为48.04%，较李驰等[20]的纯化倍数与回收率明显提高。这是由于在离子交换层析时，蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感，本研究在纯化过程中通过改变缓冲液的离子强度进行分离纯化，损失蛋白较少，并进一步通过排阻层析提高纯化倍数。

表4 琼胶酶分离纯化结果Table 4 Summary of isolation and purification procedures of agarase

2.2.4 SDS-PAGE 纯度鉴定及相对分子量测定 由图5 所示，该琼胶酶在SDS-PAGE 图谱上呈现单一条带，表明分离效果较好并且经过以上纯化步骤可以得到电泳纯酶，该酶分子量为35 kDa，与Li 等[21]的结果相近。

图5 SDS-PAGE 测定分子量结果Fig.5 Results of molecular weight determination by SDS-PAGE

2.3 琼胶酶酶学性质研究

2.3.1 琼胶酶最适温度及热稳定性 琼胶酶的最适温度及热稳定性研究结果如图6 所示，图6A 中的结果表明琼胶酶的酶活随温度的升高而增加，温度为40 ℃时酶活最高，当温度超过40 ℃后，高温使蛋白变性失活，酶促反应会受到温度的抑制，酶活力快速下降。因此该酶的最适反应温度为40 ℃，该酶在60 ℃下酶活下降80%左右，说明该琼胶酶具有一定耐热性。将琼胶酶在20、35 ℃保温8 h，酶活保持在95%以上；在40 ℃保温8 h 内，酶活保持在90%以上；而当温度为45 ℃，酶活在1 h 内降低到20%，证明该酶在20～40 ℃稳定性较好。与金佳等[22]的研究结果相比，本研究的琼胶酶温度作用范围较广且热稳定性较好。

图6 温度对酶活力的影响Fig.6 Influence of temperature on enzyme activity

2.3.2 琼胶酶最适pH 及pH 稳定性 由图7A 可知，琼胶酶的最适pH 为6.5，且该琼胶酶在pH5～8范围内具有较高的酶活力。天然海水的pH 在7.9～8.4之间，而该酶在弱酸性环境下也具有较高的酶活，说明其具有一定的耐酸性。当pH＜5 或pH＞8 时，该琼胶酶的酶活大大降低，这是由于过低或过高的pH 都会因为影响蛋白质中解离基团的解离状态而影响酶活，甚至使蛋白质失活。由图7B 可知，在最适pH环境下，该琼胶酶6 h 内的酶活维持在90%以上，结果表明该琼胶酶在弱酸性条件下稳定。

图7 pH 对酶活力的影响Fig.7 Influence of pH on enzyme activity

2.3.3 不同金属离子对酶活力影响结果 许多酶需要金属离子的存在才能发挥其催化功能，金属离子在酶的催化过程中起到的作用主要有传递电子、促进酶与底物的结合、稳定酶的分子的构象等作用。不同金属离子对琼胶酶活力影响结果如表5 所示。在50 mmol/L 浓度下，Cu2+、Zn2+、Fe3+、Al3+对琼胶酶活力具有强烈的抑制作用；Mg2+、Fe2+、Mn2+对琼胶酶活力也均有不同程度的抑制作用；原因可能在于反应体系中存在这些金属离子时影响了一些功能基团的亲和力，导致酶催化位点的结构发生变化，从而使得酶活降低[23]。而Na+、K+、Ca2+等在海水中含量丰富的离子对该酶的影响均不大，这可能与该菌株来源于海洋环境有关[24]。

表5 金属离子对琼胶酶活性的影响Table 5 Effects of metal ions on agarase activity

2.3.4 琼胶酶动力学参数结果 分别配制浓度为0.25、0.5、1、2、4 mg/mL 的底物，测定底物反应速率，按照Lineweaver-Burk 方程[25]处理，由图8 中直线在横纵轴的截距分别计算出该琼胶酶的米氏常数为13.84 mg/mL，最大反应速度Vmax为0.54 mg/mL·min。1/Km可以近似地表示酶对底物亲和力的大小，1/Km越大，Km越小，则达到酶促反应最大反应速率的一半所需要的底物浓度越小，可以表明酶和底物的亲和力越大[26]。与Alkotaini 等[27]报道的Km值16.67 mg/mL相比较而言，该琼胶酶对琼脂具有相对较高的亲和力以及催化效率。

图8 Lineweaver-Burk 作图法绘制米氏方程曲线Fig.8 Lineweaver-Burk double reciprocal plot of Michaelis-Menten equation

2.4 降解产物分析

利用电喷雾质谱技术对降解产物进行验证，如图9 所示，测得的离子峰质荷比（m/z）为：665.2[MH]+、971.4[M-H]+，根据降解产物的分子量可推知，该酶的降解产物为四糖和六糖，其中主要产物为四糖。通过13C-NMR 进一步鉴定琼胶酶的降解产物，如图10 所示，在90.72 ppm 处未检测到信号，92 ppm和96 ppm 处检测到的信号是由还原端的α-和β-异头碳引起的[28]，在97 ppm 处的信号对应于非还原端3,6-脱水乳糖，这些特征信号表明了该琼胶酶为β-琼胶酶。经MS 和13C-NMR 分析，该酶主要降解产物为新琼四糖。

图9 琼脂糖降解产物的质谱检测结果Fig.9 MS result of the hydrolysis products of purified agarase

图10 琼脂糖降解产物的13C-NMR 检测Fig.10 13C-NMR spectrum of the hydrolysis products of agarase

3 结论

本研究针对自主筛选的Sphingomonassp.Q2 菌株，通过产酶条件优化、盐析沉淀以及不同形式的柱层析等技术手段，实现电泳纯琼胶酶的分离制备。经纯化后的琼胶酶比活为112048.82 U/mg，纯化倍数为7 倍，回收率为48.04%。与现有的研究相比，得到的琼胶酶比活高且回收率高。通过对酶学性质的考察得到了最佳的反应条件：最适温度为40 ℃，最适pH 为6.5，其性质符合海洋来源琼胶酶的基本特征。动力学参数结果表明，该琼胶酶的米氏常数为13.84 mg/mL，最大反应速度Vmax为0.54 mg/mL·min，具有较高的亲和力。通过MS、13C-NMR 证明该酶为β-琼胶酶，主要降解产物为新琼四糖，能够对其结构进行验证。

通过以上对Sphingomonassp.Q2 菌株所产琼胶酶的酶学性质及降解产物的研究，充分了解其酶学性质，初步研究结果表明，该琼胶酶具有较高的酶活且产酶条件稳定，为新琼寡糖相关产物的制备提供技术基础，也为琼胶寡糖功能产品开发提供一种新型酶资源。但本文目前只局限于对野生菌产琼胶酶的初步探索，随着研究的深入还需进一步对该琼胶酶的结构、催化特异性及异源表达等方面进行探索并有望将其广泛应用到食品工业。