长链非编码RNA NKILA和微小RNA-485-5p在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达研究

裔 静 康苧心 卢海波 孙相波

南通大学第四附属医院耳鼻喉科,江苏省盐城市 224000

慢性鼻窦炎(Chronic rhinosinusitis,CRS)是慢性异质性炎性疾病,根据是否伴有鼻息肉分为慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRS with nasal polyps,CRSwNP)及慢性鼻窦炎不伴鼻息肉(CRS without nasal polyps,CRSsNP)。CRSwNP发病机制复杂,患者嗅觉减退、鼻塞、流涕、头痛等症状较为严重。研究表明,CRSwNP疾病进展与鼻黏膜组织重塑以及持续炎症浸润关系密切,持续炎症刺激可导致气道细胞外基质产生、降解异常,造成气道组织改变,进而引发鼻黏膜组织重塑[1]。核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)通路可调控多种炎症的进展,诱导促炎基因表达,并向炎症部位募集细胞因子,且能够促进CRSwNP鼻黏膜组织重塑过程[2]。当促炎细胞因子聚集时,长链非编码RNA NKILA(long non-coding RNA NKILA,LncRNA NKILA)被NF-κB信号传导转录激活,并能抑制NF-κB的活性[3]。根据以上研究猜测,NKILA可能在CRSwNP疾病进展中发挥作用,但尚未有研究报道。此外,Starbase数据库在线预测显示,NKILA与微小RNA-485-5p(microRNA-485-5p,miR-485-5p)存在靶向关系。因此,本研究通过检测NKILA、miR-485-5p在CRSwNP患者中的表达,探讨NKILA、miR-485-5p在CRSwNP发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年5月—2022年6月在本院行手术治疗的CRS患者93例,并将患者分为CRSwNP组49例(男27例,女22例),CRSsNP组44例(男25例,女19例)。CRS患者纳入标准:(1)CRS患者均符合相关诊疗指南[4];(2)患者均知情同意;(3)均无变应性鼻炎、变应性哮喘等疾病。排除标准:(1)术前1个月内接受过抗菌药物、糖皮质激素类药物治疗者;(2)妊娠期女性;(3)合并传染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病者;(4)患有肺囊性纤维化、糖尿病、高血脂、高血压、冠心病等慢性疾病者。另取同期单纯外伤性鼻中隔偏曲患者36例作为对照组(男21例,女15例),均无变应性鼻炎、哮喘等变态反应病史,且近1个月内未使用过抗菌药物、糖皮质激素类药物。本研究经医院伦理委员会审批同意(批件号:2019-012)。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集。收集所有受试对象的术前临床检查结果(鼻内镜检查、鼻窦CT检查),采用视觉量表评分(VAS)、Lund-Kennedy鼻内镜评分、Lund-Mackay鼻窦CT评分(CT评分)评估所有受试对象的疾病严重程度[4]。

1.2.2 样本采集。三组均行全身麻醉,由专业耳鼻咽喉头颈外科医生行鼻内镜手术,并于术中取CRSwNP组息肉组织、CRSsNP组钩突组织及对照组下鼻甲组织。将组织剪成黄豆大小,放入干净离心管中,液氮速冻,-80℃冰箱保存。

1.2.3 NKILA、miR-485-5p及炎症因子IL-1β、TNF-α、NF-κB水平检测。取出组织样本,研磨成组织匀浆,TRIzol法提取组织总RNA,并逆转录成cDNA,miR cDNA采用miRNA cDNA链合成试剂盒(ZY130911,上海泽叶生物科技有限公司)合成,NKILA、IL-1β、TNF-α及NF-κB基因cDNA采用逆转录试剂盒(205111,德国Qiagen公司)合成。以上述cDNA为模板,配制qRT-PCR反应体系,miR-485-5p内参为U6,NKILA、IL-1β、TNF-α及NF-κB内参为GAPDH(见表1)。于荧光定量PCR仪上检测组织中NKILA、miR-485-5p、IL-1β、TNF-α及NF-κB的水平。采用2-ΔΔCt法计算NKILA、miR-485-5p、IL-1β、TNF-α及NF-κB相对表达量。

表1 引物序列

1.2.4 生物信息学分析。下载基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中GSE136825芯片数据,并采用limma包进行差异分析。GSE136825包含6 名患有伴有鼻息肉的CRS受试者和6例不伴有鼻息肉的CRS对照组受试者 ,芯片平台是Affymetrix Human Genome U133 plus 2.0,差异结果用火山图表示,火山图采用ggplot2包绘制。

2 结果

2.1 NKILA差异分析 通过下载GEO数据库GSE136825芯片数据,采用R语言limma包进行差异分析,并用ggplot2作图,绘制差异火山图,共发现50个差异表达的LncRNA,上调LncRNA 6个,下调LncRNA 44个,其中NKILA显著上调。见图1。

图1 火山图

2.2 三组基本资料比较 三组年龄、性别及吸烟人数比较,差异无统计学意义(P>0.05);CRSwNP组、CRSsNP组的VAS评分、Lund-Kennedy鼻内镜评分、CT评分以及NKILA、IL-1β、TNF-α、NF-κB水平均高于对照组(P<0.05),miR-485-5p水平低于对照组(P<0.05);CRSwNP组VAS评分、Lund-Kennedy鼻内镜评分、CT评分、NKILA、IL-1β、TNF-α及NF-κB水平均高于CRSsNP组(P<0.05),miR-485-5p水平低于CRSsNP组(P<0.05)。见表2。

表2 三组基本资料比较

2.3 CRSwNP组患者NKILA、miR-485-5p的相关性分析 Starbase在线预测显示,NKILA、miR-485-5p存在靶向序列。见图2。Pearson法分析显示,CRSwNP组患者息肉组织中NKILA与miR-485-5p呈负相关(r=-0.609,P<0.001)。见图3。

图2 NKILA、miR-485-5p靶向关系图

图3 CRSwNP组患者NKILA与miR-485-5p的相关性图

2.4 CRSwNP组患者NKILA、miR-485-5p水平与疾病严重程度的相关性 在CRSwNP组中,NKILA水平与VAS评分、Lund-Kennedy鼻内镜评分及CT评分均呈正相关(P<0.05);miR-485-5p与VAS评分、Endoscopy评分及CT评分均呈负相关(P<0.05)。见表3。

表3 CRSwNP组患者关键指标间的相关性分析

2.5 无序多分类Logistics回归分析CRSwNP的影响因素 因变量为对照、CRSsNP及CRSwNP,分别赋值为0、1、2,以NKILA、miR-485-5p、IL-1β、TNF-α及NF-κB水平为自变量,无序多分类Logistics回归分析显示,与对照组比较,NKILA、NF-κB水平每增加0.1,CRSsNP风险分别增加2.313倍、1.625倍,miR-485-5p水平每增加0.1,CRSsNP风险下降67.4%倍;与CRSsNP患者比较,NKILA、NF-κB水平每增加0.1,CRSwNP风险分别增加2.494倍、1.562倍,miR-485-5p水平每增加0.1,CRSwNP风险下降67.7%。见表4。

表4 影响CRSwNP的无序多分类Logistics回归分析

2.6 ROC曲线分析NKILA、miR-485-5p水平对CRSwNP的诊断价值 采用ROC曲线分析NKILA、miR-485-5p水平对CRSwNP的诊断价值,结果显示,在对照组与CRSwNP组之间,NKILA、miR-485-5p诊断CRSwNP的曲线下面积分别为0.966、0.997,见图4。

图4 对照组与CRSwNP组NKILA、miR-485-5p水平诊断CRSwNP的ROC曲线

在CRSsNP组与CRSwNP组之间,NKILA、miR-485-5p诊断CRSwNP的曲线下面积分别为0.870、0.954,见图5。

图5 CRSsNP组与CRSwNP组NKILA、miR-485-5p水平诊断CRSwNP的ROC曲线

3 讨论

CRS是一种慢性复发性炎症性疾病,其特征在于鼻窦黏膜持续炎症。当CRS患者暴露于刺激物中时会导致持续炎症反应,或患者本身存在遗传易感性,均可促进鼻息肉发生[5]。炎性细胞浸润是鼻息肉的一种特征,鼻息肉可能造成鼻窦、鼻腔黏膜的破坏[6]。临床上将CRS分为CRSwNP及CRSsNP两种,二者表型及发病机制均不同,其中CRSwNP较为难治,且易复发,一项为期12年的随访研究显示,内镜鼻窦手术后CRSwNP患者的复发率甚至达到78.9%,严重影响患者生活质量[7]。

NKILA是一种LncRNA,可调控细胞或组织炎症反应。杨娟等[8]研究表明,NKILA在LPS诱导的支气管上皮细胞16HBE中呈低表达,其可通过负调控miR-1236-3p减轻16HBE细胞的炎症因子水平。本研究对GSE136825芯片进行差异分析,发现NKILA在CRS患者中显著上调,提示NKILA可能参CRSwNP的发病过程。已有研究证明,CRSwNP与炎症密切相关。NF-κB是调节细胞炎症反应和细胞因子表达的重要炎症调节因子[9],在CRS和鼻息肉组织中均被激活[10]。研究发现,NF-κB可有效地介导人类鼻息肉衍生成纤维细胞(NPDFs)的炎症变化[11]。提示,NF-κB信号在CRSwNP中可能被激活并调节细胞因子的表达。本研究分析各组炎症因子IL-1β、TNF-α及NF-κB水平,结果显示,对照组、CRSsNP组、CRSwNP组IL-1β、TNF-α及NF-κB水平依次升高,两两比较差异有统计学意义,与文献[11]研究一致,CRSwNP患者息肉组织中炎症因子水平升高。研究显示,NKILA与NF-κB相互作用,可通过抑制NF-κB调节T细胞对活化诱导细胞死亡的敏感性,此外,NKILA还可通过阻断IκB磷酸化从而抑制NF-κB介导的癌细胞迁移、凋亡,NKILA与NF-κB信号传导蛋白相互作用[12]。因此,猜测NKILA可能通过与NF-κB相互作用,参与CRSwNP的疾病进展。本研究结果显示,CRSwNP组、CRSsNP组、对照组NKILA水平依次降低,且与VAS评分、Endoscopy评分及CT评分均呈正相关,提示NKILA可能参与CRSwNP的发生发展,其机制可能与NF-κB信号通路有关,但还需进一步验证。

Starbase数据库显示,miR-485-5p含有NKILA的互补位点,提示miR-485-5p与NKILA可能存在靶向关系。miR-485-5p可能参与NKILA促进CRSwNP疾病进展的调控过程。miR-485-5p与炎症有关,Wan等[13]研究显示,糖尿病肾病患者血清中miRNA-485-5p表达下降,其水平可调节高葡萄糖诱导的炎症和氧化应激。本研究结果显示,CRSwNP组、CRSsNP组、对照组miR-485-5p水平依次升高,且与NKILA水平、VAS评分、Endoscopy评分及CT评分均呈负相关,说明miR-485-5p在CRSwNP发生发展中发挥作用,可能与NKILA负调控miR-485-5p有关。

本研究中采用无序多分类Logistics回归分析影响CRSwNP的因素,NKILA、NF-κB水平升高,CRSwNP患病风险增大,miR-485-5p水平升高,CRSwNP患病风险下降,猜测降低NKILA水平或升高miR-485-5p水平有利于降低CRSwNP的患病风险。此外,ROC曲线显示,分别分析对照组与CRSwNP组、CRSsNP组与CRSwNP组,NKILA、miR-485-5p水平对CRSwNP的诊断价值均较高,提示可通过检测NKILA、miR-485-5p水平预测CRSwNP的发生,但是否能广泛应用于临床还需进一步探究。

综上所述,CRSwNP患者息肉组织中NKILA水平升高、miR-485-5p水平下降,二者水平均与CRSwNP患者疾病严重程度有关,且对CRSwNP有一定的诊断价值,NKILA可能通过靶向miR-485-5p参与调控CRSwNP的疾病进展。但本研究未进行相关机制研究,仍需通过细胞或动物实验探究NKILA、miR-485-5p参与CRSwNP发生发展的具体作用机制。