lncRNA NKILA对鼻咽癌细胞放射抵抗和上皮间质转化的影响及其机制

张永涛，唐雪娣，徐枫钞

自贡市第一人民医院放射科，四川自贡643000

鼻咽癌是我国高发的头颈部恶性肿瘤之一，近年来其发病率不断上升，已成为严重危害居民身心健康和生活质量的重大疾病之一。目前，放疗仍然是鼻咽癌最重要的治疗手段，但部分患者存在原发性或继发性放疗不敏感，同时放疗还可介导细胞上皮间质转化（EMT），使得放疗效果不佳［1］。研究发现，放疗可诱导下咽癌细胞产生放射抵抗，并且放射抵抗细胞易发生EMT，导致其侵袭和迁移能力增强［2］。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，可通过调控基因的表达参与恶性肿瘤的生物学行为［3-4］。NKILA为lncRNA家族成员之一。有研究发现，lncRNA NKILA可通过调控NF-κB表达促进喉癌细胞的增殖和侵袭；lncRNA NKILA还可通过下调miR-889-3p表达抑制肝癌的发生、发展。这些研究表明，lncRNA NKILA能够通过调控miRNA表达对肿瘤产生一定影响。微小RNA-21（miR-21）是人类常见的原癌基因，与多种肿瘤的关系密切。miR-21在肺癌、胰腺癌、大肠癌等细胞中高表达，其高表达可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭并抑制其凋亡［5-7］。生物信息学分析显示，miR-21与lncRNA NKILA可能存在靶向调控关系，为lncRNA NKILA潜在的靶基因。但二者在鼻咽癌中的靶向调控关系尚不清楚。2022年2月—12月，本研究探讨了lncRNA NKILA对鼻咽癌细胞放射抵抗和EMT的影响及其机制。现报告如下。

1.料与方法

1.1.料 人鼻咽癌细胞CNE2，购自北京伊塔生物科技有限公司。SPF级SD裸鼠10只，雌雄各半，鼠龄5～6周，体质量18～22 g，购自上海科顺生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK（沪）20190241。ProFlexTMPCR仪，购自上海土森视觉科技有限公司。lncRNA NKILA、miR-21引物序列由广州威佳科技有限公司设计合成；NKILA-mimic、NKILA-NC质粒，购自上海数谱生物科技有限公司。MTT，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。E-cadherin、N-cadherin一抗，购自北京义翘神州科技股份有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，购自南京全隆生物技术有限公司。本研究经自贡市第一人民医院医学伦理委员会批准（伦理批号：Y2021-05-102）。

1.2.射抵抗细胞模型构建 将CNE2细胞接种于含10% FBS和1%青链霉素双抗的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱常规培养。待细胞生长至80%～90%融合时，胰蛋白酶消化并计数，按1∶3传代。取传4代、对数生长期、生长状态良好的CNE2细胞，接种于培养皿，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱常规培养。培养12 h，收集细胞，经胰蛋白酶消化后调整细胞密度至1 × 103/mL，分别予2、4、6、8、10 Gy X射线照射，每剂量照射2次，总剂量60 Gy。每次照射后，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱常规培养，待细胞生长至50%以上融合时，胰蛋白酶消化并传代。稳定传代2次后，进行下一次X射线照射。总剂量达到60 Gy后，检测放射线抵抗能力，筛选放射抵抗的CNE2细胞（其SF2值为CNE2细胞的2倍）。1.3 分组转染 收集上述细胞，接种于6孔板，随机分为空白组、NC组、转染组，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱常规培养。待细胞生长至75%融合时，参照文献［8］按LipofectamineTM2000说明，转染组和NC组分别转染NKILA-mimic、NKILA-NC质粒。空白组不予转染。转染12 h，更换为无血清的培养基，继续培养48 h。

1.4.ncRNA NKILA、miR-21表达检测 采用RT-qPCR法。取上述各组细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，然后将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列：lncRNA NKILA上游引物5'-GGTAGGGCGATTGGCGAGAC-3'、下游引物5'-TTGCGAGGGCTGAAAATGGGGA-3'，miR-21上游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'、下游引物5'-GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT-3'；U6上游引物5'-TTGAGGGATGCCCGATTGAG-3'、下游引物5'-TTGGAGGGCTGGAGGCGGGA-3'。按PCR扩增试剂盒说明配制反应体系。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s共30个循环，最后72 ℃ 8 min。以U6为内参，采用2-ΔΔCT法计算lncRNA NKILA、miR-21相对表达量。

1.5.胞增殖能力检测 采用MTT法。取上述各组细胞，接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱常规培养。分别于培养1、2、3、4、5天，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，继续培养4 h，然后加入DMSO 150 μL，轻轻振荡10 min，使结晶物充分溶解。酶标仪于570 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值。以OD570值代表细胞增殖能力。

1.6.胞侵袭和迁移能力检测 采用Transwell小室实验。①细胞侵袭能力：用Matrigel基质胶包被Transwell小室上室，静置1 h；取上述各组细胞制备细胞悬液，Transwell小室上室加入细胞悬液，下室加入完全培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养；培养2天，甲醇固定20 min，结晶紫染色10 min，显微镜下拍照并计数侵袭细胞数目。②细胞迁移能力：取上述各组细胞饥饿处理12 h，以无血清的培养基将细胞密度调整至5 × 105/mL，Transwell小室上室加入细胞悬液，下室加入完全培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养；培养16 h，甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下拍照并计数迁移细胞数目。

1.7.-cadherin、N-cadherin表达检测 采用Western blotting法。取上述各组细胞，提取细胞总蛋白，经BCA法蛋白定量合格。加入5 ×上样缓冲液，100 ℃水浴变性。取变性蛋白，SDS-PAGE分离。电泳结束，将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入E-cadherin、N-cadherin一抗，4 ℃孵育过夜。次日洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育45 min。ECL发光，暗室内显影、曝光，凝胶成像仪拍照，Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.8.向调控关系验证 通过TargetScan预测lncRNA NKILA与miR-21的靶向调控关系。取上述各组细胞，接种于6孔板，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。待细胞生长至80%以上融合时，按LipofectamineTM2000说明将miR-21-3'-UTR-WT、miR-21-3'-UTR-MUT质粒分别与NKILA-mimic质粒或NKILA-NC质粒共转染CNE2细胞。转染2天，收集细胞，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明检测荧光素酶活性。

1.9.鼠移植瘤体积测量 取SD裸鼠10只，随机分为观察组和对照组各5只。观察组与对照组分别于右前肢腋下注射转染lncRNA NKILA的放射抵抗CNE2细胞、单纯放射抵抗CNE2细胞各1 × 106个。常规饲养4周，处死裸鼠，分离移植瘤组织，测量瘤体短径（W）和长径（L），按公式计算肿瘤体积（V）。V=L × W2/2。

1.10.计学方法 采用SPSS21.0统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.果

2.1.组lncRNA NKILA、miR-21表达比较 见表1。

表1.组lncRNA NKILA、miR-21相对表达量比较（±s）

表1.组lncRNA NKILA、miR-21相对表达量比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与NC组比较，#P＜0.05。

组别空白组NC组转染组F P lncRNA NKILA 1.00 ± 0.00 1.02 ± 0.03 1.62 ± 0.17*#74.980＜0.01 miR-21 1.00 ± 0.00 0.95 ± 0.04 0.49 ± 0.02*#711.300＜0.01

2.2.组细胞增殖能力比较 见表2。

表2.组不同时间细胞增殖能力比较（±s）

表2.组不同时间细胞增殖能力比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与NC组比较，#P＜0.05。

组别空白组NC组转染组F P细胞增殖能力培养1天0.32 ± 0.03 0.31 ± 0.04 0.29 ± 0.02 1.448＞0.05培养2天0.52 ± 0.06 0.51 ± 0.05 0.38 ± 0.03*#15.690＜0.01培养3天0.74 ± 0.04 0.73 ± 0.06 0.51 ± 0.04*#44.740＜0.01培养4天1.25 ± 0.11 1.23 ± 0.14 0.64 ± 0.05*#63.210＜0.01培养5天1.70 ± 0.14 1.68 ± 0.17 1.02 ± 0.13*#41.210＜0.01

2.3 三组细胞侵袭和迁移能力比较 见表3。

表3.组细胞侵袭和迁移能力比较（个，±s）

表3.组细胞侵袭和迁移能力比较（个，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与NC组比较，#P＜0.05。

组别空白组NC组转染组F P细胞侵袭数118.22 ± 8.31 115.27 ± 10.24 54.23 ± 4.52*#120.900＜0.01细胞迁移数246.21 ± 20.32 241.35 ± 23.41 72.48 ± 6.25*#76.200＜0.01

2.4.组E-cadherin、N-cadherin蛋白表达比较 见表4。

表4.组E-cadherin、N-cadherin蛋白相对表达量比较（±s）

表4.组E-cadherin、N-cadherin蛋白相对表达量比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与NC组比较，#P＜0.05。

组别空白组NC组转染组F P E-cadherin 1.05 ± 0.08 1.07 ± 0.05 3.45 ± 0.37*#235.100＜0.01 N-cadherin 1.02 ± 0.07 1.04 ± 0.05 0.24 ± 0.03*#451.400＜0.01

2.5.ncRNA NKILA与miR-21的靶向调控关系TargetScan预测结果显示，lncRNA NKILA与miR-21存在靶向结合位点，见图1。双荧光素酶报告基因实验结果显示，共转染NKILA-mimic质粒与miR-21-3'-UTR-WT、共转染NKILA-NC质粒与miR-21-3'-UTR-WT的CNE2细胞荧光素酶活性分别为0.84 ± 0.07、1.08 ± 0.07，共转染NKILA-mimic质粒与miR-21-3'-UTR-MUT、共转染NKILA-NC质粒与miR-21-3'-UTR-MUT的CNE2细胞荧光素酶活性分别为1.11 ± 0.12、1.14 ± 0.09。共转染NKILA-mimic质粒与miR-21-3'-UTR-WT的CNE2细胞荧光素酶活性低于共转染NKILA-NC质粒与miR-21-3'-UTR-WT的CNE2细胞（t=5.938，P＜0.05），而共转染NKILA-mimic质粒与miR-21-3'-UTR-MUT、共转染NKILA-NC质粒与miR-21-3'-UTR-MUT的CNE2细胞荧光素酶活性比较差异无统计学意义（t=0.745，P＞0.05）。

图1.ncRNA NKILA与miR-21的靶向结合位点示意图

2.6.组移植瘤体积比较 观察组与对照组移植瘤体积分别为（0.70 ± 0.05）、（2.41 ± 0.08）cm3。观察组移植瘤体积低于对照组（t=40.530，P＜0.05）。

3.论

目前，放疗仍然是鼻咽癌最重要的治疗手段，但部分患者存在原发性或继发性放疗不敏感，使得放疗效果不佳，预后较差。但鼻咽癌细胞放射抵抗的具体机制尚不清楚。

lncRNA、miRNA均属于非编码RNA，作为重要的调控分子参与生命活动过程。普遍认为，miRNA、lncRNA与肿瘤细胞放射抵抗有关，可能是改善放疗敏感性的潜在靶标。lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA。越来越多证据表明，lncRNA在细胞增殖、分化、凋亡等生命活动中发挥重要作用。lncRNA NKILA是lncRNA家族成员之一。有研究证实，lncRNA NKILA可通过靶向调控miR-1236-3p表达改善脂多糖诱导的支气管上皮细胞损伤［9］，提示lncRNA NKILA能够靶向调控miRNA。miRNA是一类内源性非编码小分子RNA，也能参与细胞的增殖、分化、凋亡等生命活动。miR-21是人类常见的原癌基因，与多种肿瘤关系密切。有研究报道，miR-21不仅能促进食管癌细胞的增殖、侵袭和迁移，还能参与调控食管癌细胞的放疗敏感性［10］。罗轶等［11］研究报道，沉默miR-21可降低鼻咽癌细胞活性并抑制其放射抵抗。生物信息学分析显示，miR-21与lncRNA NKILA可能存在靶向调控关系，为lncRNA NKILA潜在的靶基因。但二者在鼻咽癌中的靶向调控关系尚不清楚。

为了探究lncRNA NKILA对鼻咽癌细胞放射抵抗的影响及其机制，本研究构建了鼻咽癌放射抵抗细胞模型并转染NKILA-mimic质粒，结果显示，转染NKILA-mimic质粒后放射抵抗的CNE2细胞增殖能力显著降低。进一步研究发现，在放射抵抗的CNE2细胞中，转染NKILA-mimic质粒后miR-21表达降低，而转染NKILA-NC质粒后miR-21表达变化不明显，提示miR-21可能是lncRNA NKILA的靶基因，lncRNA NKILA可能通过靶向抑制miR-21表达而抑制鼻咽癌细胞的放射抵抗。此外，本研究观察组移植瘤体积显著低于对照组，进一步证实了上述结论。

放疗敏感性与EMT密切相关，抑制肿瘤细胞EMT可能是增强放疗敏感性的一种策略。在EMT过程中，细胞发生形态改变，呈梭形转变，细胞极性丧失、黏附性降低，并获得间质细胞的表型特征，从而使肿瘤细胞获得更强的侵袭和迁移能力。作为EMT的标志性蛋白，E-cadherin低表达是EMT最显著的特征，也是多种肿瘤发生转移和预后不良的重要标志物；N-cadherin表达增加，可促进肿瘤细胞脱离原位并粘附基质成分，细胞运动能力增强，从而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。有研究证实，鼻咽癌细胞发生EMT时N-cadherin表达上调、E-cadherin表达下调，肿瘤细胞的侵袭和迁移能力显著增强［12］。有研究报道，miR-21可上调肿瘤细胞中E-cadherin表达，抑制EMT发生，从而降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力［13］。本研究结果发现，转染组E-cadherin表达显著高于空白组和NC组，N-cadherin表达及细胞侵袭和迁移能力显著低于空白组和NC组，提示lncRNA NKILA能够阻滞鼻咽癌细胞发生EMT，进而抑制其侵袭和迁移。李欢庆等［14］研究发现，转染miR-21能够上调E-cadherin表达、下调Vimentin表达，阻滞鼻咽癌细胞发生EMT，抑制其侵袭和迁移。张印松等［15］研究报道，lncRNA NKILA通过靶向抑制NF-κB表达，抑制喉癌细胞的侵袭能力。LIU等［16］研究发现，lncRNA NKILA可通过调控IL-11/STAT3信号通路，抑制肺癌细胞的增殖和迁移。本研究经TargetScan预测和双荧光素酶报告基因实验证实，lncRNA NKILA能够靶向抑制miR-21表达，抑制鼻咽癌细胞发生EMT，从而抑制其侵袭和迁移。

综上所述，lncRNA NKILA可能通过靶向抑制miR-21表达而抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移，继而抑制鼻咽癌细胞的放射抵抗和EMT。