骨髓间充质干细胞来源外泌体中lncRNA SNHG12对心肌细胞的影响及其机制

王德霞，赵勇，李荣，辛辉

1 青岛大学附属医院心血管内科，山东青岛266000；2 枣庄市山亭区人民医院心内科

心肌梗死是临床常见的心血管疾病，近年来其发病率和死亡率居高不下，严重影响患者生活质量甚至危及生命［1］。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一种来源于骨髓的多能干细胞，具有体外扩增能力强、免疫原性低和多向分化潜能等特点，是组织工程和细胞治疗的常用种子细胞。研究发现，心肌梗死后移植BMSCs能够显著促进梗死区域新生血管形成和受损心肌修复［2］。而BMSCs来源的外泌体被证实可提供与BMSCs相似的心脏保护作用［3］。长链非编码RNA（lncRNA）是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，可通过竞争内源性RNA机制参与多种心血管疾病的发生、发展［4-5］。小核仁RNA宿主基因12（SNHG12）是一种具有低编码概率的lncRNA，在多种恶性肿瘤中表达上调，并扮演致癌基因的角色［6］。研究发现，lncRNA SNHG12可通过miR-218-5p/胰岛素样生长因子2轴调节动脉粥样硬化中氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞损伤［7］，提示lncRNA SNHG12能够抑制心血管疾病的发生、发展。但lncRNA SNHG12对心肌细胞保护的作用机制尚未阐明。2022年2月—2023年3月，本研究探讨了BMSCs来源外泌体中lncRNA SNHG12对心肌细胞的影响及其机制。现报告如下。

1.料与方法

1.1.料 大鼠BMSCs及心肌细胞H9c2，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。SNHG12、SH-沉默信息调节因子1（SIRT1）、miR-138-5p抑制剂及其相应的阴性对照，由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。IX51倒置显微镜，购自日本Olympus公司；凝胶成像仪，购自美国Bio-Rad公司；Multiskan FC酶标仪，购自美国Thermo公司。CD9、CD63一抗，购自英国Abcam公司；肿瘤易感基因101（TSG101）、核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、剪切的半胱氨酸蛋白酶1（Cleaved-Caspase-1）、剪切的焦孔素D（Cleaved-GSDMD）一抗，购自美国Cell Signaling Technology公司。IgG二抗，购自武汉塞维尔生物科技有限公司。外泌体提取试剂盒，购自美国Thermo公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；IL-1β、IL-18 ELISA试剂盒，购自美国R&D公司；CCK-8试剂盒，购自美国GLPBIO公司。

1.2.MSCs转染与外泌体提取 采用贴壁法分离培养BMSCs并传代。取传3代BMSCs细胞3 × 105个，接种至6孔板，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。待BMSCs生长至40%～60%融合时，按Lipofectamine®3000说明分别转染SNHG12。转染48 h，收获细胞并分离外泌体。当BMSCs生长至80%融合时，用无外泌体的培养基培养48 h，收集上清液。上清液以2 000 × g离心20 min，再以10 000 × g离心40 min，然后用0.22 μm无菌过滤器过滤。将上清液以100 000 × g超速离心70 min，重悬于PBS中，再以100 000 × g离心70 min除去任何剩余的RNA，并用含PBS和RNAse Ⅰ的混合物稀释，最终获得外泌体悬浮液。

1.3.MSCs来源外泌体鉴定 取部分外泌体悬浮液，加入适量RIPA裂解液充分裂解，提取外泌体总蛋白。加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性。取变性蛋白，SDS-PAGE分离。电泳结束，湿转法转至PVDF膜上。TBST洗膜，5%脱脂牛奶室温封闭，然后分别加入CD9、CD63、TSG101一抗，4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜后滴加IgG二抗，室温孵育1 h。TBST洗膜，ECL发光，凝胶成像仪曝光并采集图像。

1.4.氧模型建立 取H9c2细胞，随机分为阴性对照（NC）外泌体组与SNHG12外泌体组，分别加入等体积NC外泌体、SNHG12外泌体转染；SNHG12外泌体 + miR138-5p抑制剂组与SNHG12外泌体 + NC抑制剂组，分别加入等体积SNHG12外泌体 +miR138-5p抑制剂及SNHG12外泌体 + NC抑制剂转染；SNHG12外泌体 + SH-NC组与SNHG12外泌体 +SH-SIRT1组，分别加入等体积SNHG12外泌体 +SH-NC及SNHG12外泌体 + SH-SIRT1转染。然后根据KOYAMA等［8］的方法制备缺氧溶液，将各组细胞与缺氧溶液共孵育6 h，建立体外缺氧细胞模型。

1.5.症因子检测 收集各组细胞培养液，离心留取上清液。采用ELISA法检测上清液IL-1β、IL-18。

1.6.泌体特异性生物标志物及细胞焦亡相关蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集各组细胞，加入RIPA裂解液充分裂解，提取细胞总蛋白。加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性。取变性蛋白，SDS-PAGE分离。电泳结束，湿转法转至PVDF膜上。TBST洗膜，5%脱脂牛奶室温封闭，然后分别加入NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD一抗，4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜后滴加IgG二抗，室温孵育1 h。TBST洗膜，ECL发光，凝胶成像仪曝光并采集图像。采用Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。

1.7.胞活力检测 采用CCK-8法。收集各组细胞，接种至96孔板，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养24 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育2 h。酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值。

1.8.胞凋亡率检测 采用TUNEL法。收集各组细胞，4%多聚甲醛固定，PBS润洗，置于冰上并使用0.1%Triton X-100透化处理，然后加入TUNEL反应液，室温黑暗孵育1 h。PBS洗涤，DAPI衬染细胞核。荧光显微镜下采集图像，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=每视野TUNEL染色阳性细胞数/总细胞数 × 100%。

1.9.计学方法 采用GraphPad7.0统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，结果比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.果

2.1.MSCs来源外泌体鉴定 经鉴定，BMSCs来源外泌体特异性标志物CD9、CD63、TSG101表达均呈阳性，证实成功获取BMSCs来源外泌体。

2.2.MSCs来源外泌体中SNHG12对体外缺氧心肌细胞的影响 NC外泌体组与SNHG12外泌体组细胞凋亡率、细胞活力及上清液IL-1β、IL-18水平比较见表1，NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表达比较见表2。

表1.C外泌体组与SNHG12外泌体组细胞凋亡率、细胞活力及上清液IL-1β、IL-18水平比较（±s）

表1.C外泌体组与SNHG12外泌体组细胞凋亡率、细胞活力及上清液IL-1β、IL-18水平比较（±s）

注：与NC外泌体组比较，*P＜0.05。

组别NC外泌体组SNHG12外泌体组细胞凋亡率（%）18.20 ± 3.03 14.00 ± 1.53*细胞活力（%）1.55 ± 0.32 2.39 ± 0.34*IL-1β（pg/mL）347.26 ± 18.06 99.68 ± 11.95*IL-18（pg/mL）194.59 ± 6.01 72.15 ± 10.34*

表2.C外泌体组与SNHG12外泌体组NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白相对表达量比较（±s）

表2.C外泌体组与SNHG12外泌体组NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白相对表达量比较（±s）

注：与NC外泌体组比较，*P＜0.05。

组别NC外泌体组SNHG12外泌体组0.32 ± 0.04 0.15 ± 0.03*0.33 ± 0.07 0.18 ± 0.04*0.34 ± 0.06 0.17 ± 0.05*0.37 ± 0.07 0.21 ± 0.06*NLRP3ASCCleaved-Caspase-1Cleaved-GSDMD

2.3.调miR-138-5p表达后BMSCs来源外泌体中SNHG12对体外缺氧心肌细胞的影响 在缺氧心肌细胞中，下调miR-138-5p表达后，BMSCs来源外泌体中SNHG12可导致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表达降低，细胞活力升高、细胞凋亡率降低（P均＜0.05），见表3、4。

表3.NHG12外泌体 + NC抑制剂组与SNHG12外泌体 + miR-138-5p抑制剂组NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和Cleaved-GSDMD蛋白相对表达量比较（±s）

表3.NHG12外泌体 + NC抑制剂组与SNHG12外泌体 + miR-138-5p抑制剂组NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和Cleaved-GSDMD蛋白相对表达量比较（±s）

注：与SNHG12外泌体 + NC抑制剂组比较，*P＜0.05。

组别SNHG12外泌体 + NC抑制剂组SNHG12外泌体 + miR-138-5p抑制剂组NLRP3 0.56 ± 0.11 0.37 ± 0.05*ASC 0.29 ± 0.03 0.15 ± 0.03*Cleaved-Caspase-1 0.61 ± 0.03 0.53 ± 0.14*Cleaved-GSDMD 0.42 ± 0.04 0.22 ± 0.04*

表4.NHG12外泌体 + NC抑制剂组与SNHG12外泌体 + miR-138-5p抑制剂组细胞活力、细胞凋亡率比较（%，±s）

表4.NHG12外泌体 + NC抑制剂组与SNHG12外泌体 + miR-138-5p抑制剂组细胞活力、细胞凋亡率比较（%，±s）

注：与SNHG12外泌体 + NC抑制剂组比较，*P＜0.05。

组别SNHG12 外泌体 + NC抑制剂组SNHG12 外泌体 + miR-138-5p抑制剂组细胞活力1.71 ± 0.26 2.06 ± 0.37*细胞凋亡率27.04 ± 3.52 19.83 ± 2.27*

2.4.调SIRT1表达后BMSCs来源外泌体中SNHG12对体外缺氧心肌细胞的影响 在缺氧心肌细胞中，下调SIRT1表达后，BMSCs来源外泌体中SNHG12可导致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表达升高，细胞活力降低、细胞凋亡率升高（P均＜0.05），见表5、6。

表5.NHG12外泌体 + SH-NC组与SNHG12外泌体 + SH-SIRT1组NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和Cleaved-GSDMD蛋白相对表达量比较（±s）

表5.NHG12外泌体 + SH-NC组与SNHG12外泌体 + SH-SIRT1组NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和Cleaved-GSDMD蛋白相对表达量比较（±s）

注：与SNHG12外泌体 + SH-NC组比较，*P＜0.05。

组别SNHG12外泌体 + SH-NC组SNHG12外泌体 + SH-SIRT1组NLRP3 0.20 ± 0.05 0.48 ± 0.04*ASC 0.48 ± 0.08 0.64 ± 0.10*Cleaved-Caspase-1 0.39 ± 0.05 0.50 ± 0.02*Cleaved-GSDMD 0.33 ± 0.02 0.49 ± 0.16*

表6.NHG12外泌体 + SH-NC组与SNHG12外泌体 +SH-SIRT1组细胞活力、细胞凋亡率比较（%，±s）

表6.NHG12外泌体 + SH-NC组与SNHG12外泌体 +SH-SIRT1组细胞活力、细胞凋亡率比较（%，±s）

注：与SNHG12外泌体 + SH-NC组比较，*P＜0.05。

组别SNHG12 外泌体 + SH-NC组SNHG12 外泌体 + SH-SIRT1组细胞活力1.44 ± 0.20 0.99 ± 0.27*细胞凋亡率18.30 ± 1.55 21.23 ± 2.86*

3.论

心肌梗死是临床常见的急危重症之一，典型临床表现为突然发作剧烈而持久的胸骨后或心前区压榨性疼痛，休息或含服硝酸甘油不能缓解，常伴有烦躁不安、出汗、恐惧或濒死感。在心肌梗死过程中，当冠状动脉粥样硬化斑块破裂或急性血栓形成时，会导致冠状动脉管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧和能量代谢障碍，最终导致心肌细胞死亡［9］。因此，挽救和修复受损的心肌细胞是心肌梗死治疗的重要目标。

BMSCs是一类起源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，是当前再生医学中最有潜力的种子细胞。外泌体是一种由活体细胞通过胞吐方式释放的小囊泡，其内包含细胞的DNA、RNA、蛋白质等生物活性物质，可介导细胞间的信息传递。近年来，外泌体已经被广泛地应用于临床疾病诊治和生物技术领域，如干细胞治疗、基因递送、药物运载等。将外泌体注射到心肌梗死早期的心肌组织中，能够显著抑制心肌细胞凋亡［10］。研究表明，BMSCs可通过释放外泌体的方式，提供多种生物活性分子来修复受损的心肌细胞、减少梗死周边区域的心肌细胞凋亡，促进损伤心肌的再生性修复［11］。lncRNA是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，可通过竞争内源性RNA机制参与多种心血管疾病的发生、发展［4-5］。在心血管疾病中，lncRNA已被证实可通过调节心肌细胞增殖、凋亡以及心肌肥厚、纤维化和血管生成等，改善心功能障碍［12］。外泌体来源lncRNA可抑制心肌细胞凋亡和焦亡，从而发挥对心肌细胞的保护作用［13］。BMSCs衍生的外泌体lncRNA mir9-3hg可通过Pum2/PRDX6轴抑制缺血再灌注小鼠心肌细胞铁死亡［14］。lncRNA SNHG12是一种具有低编码概率的lncRNA，定位于人染色体1q25.1区域。有研究报道，SNHG12高表达可促进肿瘤细胞增殖、阻遏细胞周期进程、抑制肿瘤细胞凋亡以及诱导肿瘤新生血管形成等，从而促进肿瘤的侵袭和转移［6］。因此，lncRNA SNHG12被认为是一种潜在的肿瘤诊断标志物和治疗靶点。但在心肌梗死中BMSCs来源外泌体中lncRNA SNHG12对心肌细胞的影响及其机制尚不清楚。

本研究结果发现，在体外缺氧细胞中，SNHG12外泌体组细胞凋亡率显著低于NC外泌体组，细胞活力显著高于NC外泌体组。提示BMSCs来源外泌体中lncRNA SNHG12对心肌细胞具有保护作用。心肌梗死后会引起强烈的全身和局部炎症反应，抑制或减弱炎症反应有利于心肌缺血再灌注后心肌细胞存活［15］。细胞焦亡是一种炎症性细胞程序性死亡方式。Caspase-1在细胞焦亡中起着至关重要的作用，Caspase-1激活可触发炎症因子IL-1β、IL-18释放［16］。靶向细胞焦亡的抑制剂可减少心肌梗死面积和抑制炎症反应。细胞焦亡的特征在于GSDMD介导的膜孔形成，细胞肿胀和快速裂解，随后大量释放促炎症介质［17］。NLRP3是启动细胞焦亡的必要条件，心肌梗死患者血浆NLRP3水平显著升高［18］。本研究结果发现，在体外缺氧细胞中，SNHG12外泌体组NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表达和上清液IL-1β、IL-18水平均显著低于NC外泌体组，细胞活力显著高于NC外泌体组。提示BMSCs来源外泌体中lncRNA SNHG12能够抑制心肌细胞炎症反应及心肌细胞焦亡和凋亡。抑制miR-138-5p表达和过表达SNHG12均可上调SIRT1表达。研究发现，SIRT1在心肌梗死中具有心肌保护作用，敲除SIRT1基因小鼠心肌梗死面积显著增大，而过表达SIRT1基因小鼠心肌梗死面积显著缩小［19］。有研究证实，miR-138-5p可特异性结合SIRT1［20］，而lncRNA SNHG12可靶向miR-138-5p［21］。本研究结果发现，下调miR-138-5p表达后，BMSCs来源外泌体中SNHG12可导致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表达显著降低，细胞活力显著升高、细胞凋亡率显著降低；下调SIRT1表达后，BMSCs来源外泌体中SNHG12可导致NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、Cleaved-GSDMD蛋白表达显著升高，细胞活力显著降低、细胞凋亡率显著升高。提示BMSCs来源外泌体中lncRNA SNHG12可能通过调节miR-138-5p/SIRT1轴抑制心肌细胞炎症反应及心肌细胞焦亡和凋亡。

综上所述，BMSCs来源外泌体中lncRNA SNHG12可能通过调节miR-138-5p/SIRT1轴抑制心肌细胞炎症反应及心肌细胞焦亡和凋亡，从而发挥对心肌细胞的保护作用。