氢分子在预防肠粘连中的疗效分析

杨振，李德政，魏传奎，殷殷，贾陌杨

1.山东第一医科大学第二附属医院胃肠外科，山东泰安 271000；2.山东第一医科大学第二附属医院普外科，山东泰安 271000；3.山东第一医科大学第二附属医院检验科，山东泰安 271000；4.山东第一医科大学第二附属医院消化科，山东泰安 271000

肠粘连是一种常见的外科术后并发症，其主要表现是肠道相互粘连或者肠道与腹壁粘连，其机制与组织缺血、术中机械损伤、异物刺激、术中出血、渗出物过多等引发的局部过度炎症反应有关[1-2]。尽管许多药物如糖皮质激素、右旋糖苷等对预防术后肠相互粘连起到一定的作用，但是临床上暂时没有疗效更好的药物可以使用[3]。因此，探索并开发出一种新的可以有效预防肠粘连的方法至关重要。

氢气是自然界中最小、最简单的分子，氢气的应用形式其一是通过水电解法得到氢气，向水中通入，得到富氢水溶液，其二是利用含氢化合物的分解从而得到氢气。氢被认为具有抗炎效应，是公认的抗氧剂[4]。基于此，本研究以2022年5月—2023年1月从山东第一医科大学动物实验中心购买40只SD大鼠为研究对象。将其中30只SD大鼠行锉刀摩擦盲肠术建立腹腔粘连模型，作为实验组，10只未建模型的SD大鼠作为假手术组（Sham组），旨在为肠粘连的预防和治疗提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

购买40只6～7周龄的SD大鼠。其中雌鼠20只，雄鼠20只，40只大鼠体质量180～210 g。将40只SD大鼠随机分为假手术组（Sham组）、生理盐水组（NC组）、医用透明质酸钠（HA组）、富氢水治疗组（HRS组），每组10只。4组大鼠在周龄、体质量方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。具有可比性。见表1。本研究均得到了医院医学伦理委员会的批准（编号：2022-128），并符合美国国立卫生研究院的动物护理和使用指南。

表1 4组大鼠一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 制备富氢水 以2 L自来水为一个小单位，每一个小单位中插入一个由上海酸人生科技有限公司提供的金属镁型氢棒，密封容器12 h后得到饱和氢水，用自来水稀释氢水，得到富氢水溶液，浓度为0.6 mmol/L。

1.2.2 器械 经高压灭菌并37℃干燥的规格为40 mm×50 mm的干纱布；持针器、手术刀、组织钳、眼科剪、锉刀、零号无菌丝线等。

1.2.3 手术方法 除Sham组大鼠仅行开、关腹手术未建立腹腔粘连模型外，其余3组均行锉刀摩擦盲肠术建模[5]。实验大鼠在术前进行禁食水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠（45 mg/kg）（国药准字H31021846，规格：100 mg）。麻醉后取仰卧位，消毒手术周围，无菌操作下取两处髂前上棘连线中点上方2 cm处进行手术切口，暴露盲肠部位，置于干纱布上5 min使其干燥。随后在盲肠两侧用锉刀磨擦盲肠，使其表面形成约5 cm×4 cm的受损创面，最后用1-0号丝线依次逐层关闭腹腔。术后次日起，向生理盐水组腹腔注射生理盐水（10 mL/kg），HA组大鼠于关腹前在磨损的创面上均匀涂抹医用透明质酸钠2 mL，HRS组腹腔注射富氢水（0.4 MPa条件下制备氢气饱和生理盐水，氢气浓度为0.6 mmol/L，γ射线消毒灭菌，剂量：10 mL/kg），1次/d，连续注射7 d。

1.3 观察指标

1.3.1 ELISA检测炎症因子的表达 采用酶联免疫吸附法检测血清中白介素-6（interleukin-6, IL-6）、白介素-1β（interleukin, IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）和转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）的表达。

1.3.2 腹部粘连程度评估 7 d后，如前所述对大鼠进行麻醉并处死，腹腔通过U形切口打开。腹腔内粘连的状态由两位不知道实验分组的实验人员使用Nair’s评分系统评估[6]，根据Nair 5分级标准（0级：完全无粘连，计0分；Ⅰ级：单个纤细粘连，计1分；Ⅱ级：单个或2个轻度粘连，粘连带宽＜1 cm，计2分；Ⅲ级：重度粘连，2个以上粘连或1个粘连带宽＞1 cm，计3分；Ⅳ级：广泛的或切口下的粘连，计4分），记录腹膜粘连得分。

1.3.3 组织羟脯氨酸水平（hydroxyproline）的检测将盲肠与腹壁切口组织分别制成组织匀浆，4 500r/min离心10 min后取上清液，按照试剂盒说明分别测定样本的羟脯氨酸和蛋白质水平的含量，以羟脯氨酸和蛋白质含量之比来表示组织羟脯氨酸水平。

1.4 统计方法

应用SPSS 20.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料用（±s）表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠Nair's评分比较

与Sham组比较，其余3组大鼠Nair's评分均较高，NC组高于HA组和HRS组，差异有统计学意义（P＜0.05）。且HA组高于HRS组，差异有统计学意义（t=4.68，P＜0.05）。见表2。

表2 4组大鼠Nair's评分比较[(±s)，分]

表2 4组大鼠Nair's评分比较[(±s)，分]

项目Nair's评分Sham组（n=10）0.56±0.37 NC组（n=10）3.43±0.54 HA组（n=10）2.63±0.56 HRS组（n=10）1.50±0.52

2.2 4组大鼠炎症因子水平比较

与HA组比较，HRS组大鼠术后肠粘连组织血清中IL-6、TNF-α、IL-1β和TGF-β1水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 4组大鼠炎症因子水平比较[(±s)，pg/mL]

表3 4组大鼠炎症因子水平比较[(±s)，pg/mL]

注：*表示和Sham组比较，P＜0.05；#表示和HA组比较，P＜0.05。

项目IL-6 TNF-α IL-1β TGF-β1 Sham组（n=10）278.34±28.63 256.44±23.52 342.24±41.82 227.65±21.74 NC组（n=10）（657.13±72.53）*（564.23±61.32）*（767.42±84.78）*（556.64±55.77）*HA组（n=10）（546.58±58.93）*（412.44±44.33）*（554.23±56.88）*（389.34±41.77）*HRS组（n=10）（365.49±34.71）#（289.54±33.98）#（433.39±36.74）#（312.21±33.42）#

2.3 4组大鼠组织羟脯氨酸水平比较

NC组、HA组及HRS组盲肠羟脯氨酸水平明显高于Sham组，NC组明显高于HA组及HRS组，且HA组高于HRS组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 4组大鼠组织羟脯氨酸水平比较[(±s)，μg/mg]

表4 4组大鼠组织羟脯氨酸水平比较[(±s)，μg/mg]

项目羟脯氨酸水平Sham组（n=10）45.67±4.99 NC组（n=10）126.56±12.27 HA组（n=10）97.67±10.22 HRS组（n=10）73.67±9.03

3 讨论

术后肠粘连是腹部手术后出现的腹盆腔壁层腹膜与脏层腹膜、脏层腹膜与脏层腹膜之间的粘连，其发生率高达90%[7]。正常状态下，纤维蛋白溶解与沉积之间保持动态平衡，而腹部手术之后因为患者卧床，胃肠运动减慢，使局部组织缺血受损，引发肠系膜的防御性炎症反应，纤维溶解作用受到抑制，蛋白沉积增多从而导致粘连形成。这给患者的身心健康带来极大威胁[8]。因此，从根源上积极寻找预防术后肠粘连的方法对减轻术后粘连，缓解患者的身心健康至关重要。

本研究发现，与Sham组比较，NC组、HRS组及HA组大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β等炎症因子明显升高；与NC组比较，HRS组及HA组大鼠的上述炎症因子明显降低；但与HA组比较，HRS组中IL-6（365.49±34.71）pg/mL、TNF-α（289.54±33.98）pg/mL、IL-1β（433.39±36.74）pg/mL、TGF-β1（312.21±33.42）pg/mL的降低更为明显（P＜0.05）。众所周知，氢分子具有抗炎、抗氧化等生物学效应[9]。国内的一些学者发现，氢生理盐水能有效抑制缺血再灌注肝组织氧化应激，减轻缺血再灌注肝组织炎性反应[10]。Nogueira JE等[11]发现，氢分子可以减少体育锻炼中的炎症因子的释放。探其机制，可能是由于氢分子可以通过抑制ERK/JNK/p-p38MAPK信号传导途径，从而减少了炎症反应[12]。在本研究中发现HRS治疗可显著减轻小鼠术后粘连组织中的炎症反应。这和Lin CP等[13]的研究有异曲同工之妙，Lin CP等的研究表明，富氢水可防止乙醇诱导的肝组织损伤，抑制组织中促炎细胞因子TNF-α（42.0±2.4）pg/mg和IL-6（17.1±2.5）pg/mg以及丙二醛（4.8 nmol/mg）的产生。

本文同时也检测了组织羟脯氨酸的水平，发现与Sham组比较，NC组盲肠羟脯氨酸水平明显升高，而富氢水干预后羟脯氨酸水平显著降低，这表明，富氢水的治疗可减轻术后粘连组织中纤维结缔组织的增生。组织羟脯氨酸水平是胶原中特有的氨基酸，据报道，组织羟脯氨酸水平与机体粘连程度分级呈正相关关系，损伤后羟脯氨酸在逐渐愈合的组织中的水平显著增加，因此判断粘连程度时，组织羟脯氨酸水平可作为有效指标[14]。在腹腔粘连小鼠模型中，粘连小鼠在第2周和4周的羟脯氨酸水平明显高于经过药物治疗的小鼠[15]，这在Karaman K等[16]的研究中也得到了证实。表明氢气的治疗可减轻术后粘连组织中纤维结缔组织的增生，这与本研究一致。

综上所述，本研究证实富氢水可显著抑制术后粘连组织的炎症反应和氧化应激，并抑制组织中纤维结缔组织的增生，有效减少肠粘连的形成。这对临床术后肠粘连的预防和治疗提供了一种新的思路，或可作为临床术后粘连的辅助治疗手段。当然，本研究也存在一定的局限性，本实验动物样本较少，后续将进行更大量的样本进行研究。