银杏叶提取物对结肠癌患者SW480细胞增殖的影响

关毅，畅立强

1.新疆五家渠第六师总医院普外一科，新疆五家渠 831300；2.山西省中医药研究院肛肠科，山西太原 030001

结肠癌发生原因复杂多样，涉及遗传、环境、生活方式等因素[1]。结肠癌通常发生在50岁以上的人群中[2]，年龄是结肠癌的一个重要危险因素。男性比女性更容易患结肠癌。结肠癌是一种恶性肿瘤，如果不及时治疗，肿瘤会继续生长和扩散，甚至会引起肠梗阻、穿孔和腹膜转移等严重后果，对患者的健康造成严重的危害。且结肠癌的早期症状不明显，可能只有轻微的腹泻、腹痛或不适，或者没有任何症状。一旦病情发展到晚期，治疗难度会增加，患者的生存率也会大大降低[3-4]。因此，对结肠癌而言，最关键的是采取高效的治疗药物或方式进行治疗。银杏叶提取物是当前临床治疗结肠癌的一种常用药物成分[5]。为此，本文选择2022年1—12月新疆五家渠第六师总医院的10份结肠癌标本为研究对象，就银杏叶提取物对结肠癌患者SW480细胞增殖的影响进行临床研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

选择本院10份结肠癌标本为研究对象，以及中国南京博瑞公司所产的银杏叶提取物EGB761，浓度稀释所用的材料为二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）。另准备南通碧云天生物科技公司所产的高糖DMEM培养基、细胞增殖和毒性检测剂盒（CCK-8）、胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、RIPA细胞裂解液、胰蛋白酶溶液，同时使用美国Santa Cruz公司所产的兔抗人多克隆抗体Ki67和小鼠抗人单克隆抗体PCNA以及江苏南通碧云天生物科技公司生产的β-actin抗体。

1.2 方法

在检测银杏叶提取物EGB761对结肠癌细胞SW480的细胞增殖抑制率之前，预先制备1×105/mL的细胞悬液并将其接种于96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液。经过24 h的37℃、5%CO2培养，每孔分别加入0.5 mg/mL不同质量的银杏叶提取物为银杏叶提取物组，剂量分别为20、40、60、80、100 μL，从而获得100、200、300、400、500 mg/L的浓度，上述的每个浓度都设置了3个重复孔，另设对照组（DMSO），数量与以上相等。将相应的空白孔调零，操作人员将不同浓度的银杏叶提取物分别处理细胞2 d、3 d后，在每个孔中将10 μL CCK-8试剂加入并培养3 h，之后对各孔的吸光度（optical density,OD）值进行检测，检测时的酶标仪波长为450 nm，同时将培养液作为空白对照并调零。最后，通过计算细胞增殖抑制率（inhibition rate, IR），即IR=（1-各银杏叶提取物组吸光度均值/空白对照组吸光度均值）×100%，来比较不同浓度银杏叶提取物对细胞增殖的影响。每个样本均测量了3次并取平均值，以评估不同组之间的差异。

Western Blot的具体检测方法为：用RIPA细胞裂解液提取不同组别的SW480细胞总蛋白，然后用分光光度仪测量蛋白质浓度。接下来，将蛋白样品进行加热变性处理，然后进一步实施聚丙烯酰胺凝胶电泳，成功完成电泳操作之后间蛋白质转移至PVDF膜上封闭处理2 h，再将兔抗人Ki67和羊抗人PCNA的一级抗体加入，在4℃过夜后加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的鼠抗兔及鼠抗羊二级抗体室温下孵育0.5 h。经PBS洗涤3次后，用ECL发光显影方法检测蛋白质的表达情况。

1.3 观察指标

①100、200、300、400、500 mg/L浓度银杏叶提取物处理后其吸光度、抑制率，并与空白对照组比较；②比较不同浓度下活性氧（reactive oxygen species,ROS）、X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP）mRNA表达水平。

1.4 统计方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度银杏叶提取物对结肠癌SW480细胞增殖抑制率的影响

200、300、400、500 mg/L浓度时的吸光度与空白对照组比较，差异有统计学意义（t=4.106、11.474、12.135、13.966，P＜0.05）。100、200、300、400、500 mg/L浓度银杏叶提取物处理后的抑制率分别与空白对照组比较，差异有统计学意义（t=76.963、31.821、29.747、29.461、33.614，P＜0.05）。见表1。

表1 不同浓度银杏叶提取物对结肠癌SW480细胞增殖抑制率的影响(±s)

表1 不同浓度银杏叶提取物对结肠癌SW480细胞增殖抑制率的影响(±s)

注：*与空白对照比较，P＜0.05。

项目吸光度450抑制率（%）空白对照组（n=10）1.125±0.139 0.002±0.001银杏叶提取物组（n=10）100 mg/L 1.145±0.214（3.020±0.124）*200 mg/L（0.943±0.018）*（12.500±1.242）*300 mg/L（0.616±0.017）*（40.000±4.252）*400 mg/L（0.571±0.039）*（43.100±4.626）*500 mg/L（0.508±0.014）*（45.200±4.252）*

2.2 各组ROS 、XIAP mRNA 表达水平比较

100、200、300、400、500 mg/L浓度银杏叶提取物处理后的ROS、XIAP mRNA表达水平与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组ROS、XIAP mRNA 表达水平比较(±s)

表2 各组ROS、XIAP mRNA 表达水平比较(±s)

注：*与空白对照比较，P＜0.05。

项目ROS（ng/μl）XIAP mRNA空白对照组（n=10）213.73±14.64 6.26±0.63银杏叶提取物组（n=10）100 mg/L（263.46±16.79）*（5.89±0.52）*200 mg/L（295.76±20.37）*（5.24±0.53）*300 mg/L（362.63±21.88）*（4.36±0.45）*400 mg/L（475.45±22.74）*（3.36±0.75）*500 mg/L（503.55±23.39）*（2.86±0.22）*

3 讨论

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，成为了全球健康领域的重要问题。随着近年临床对结肠癌的深入研究发现，结肠癌的发生发展与SW480细胞增殖有着密切的联系，而银杏叶提取物能够有效地抑制SW480细胞增殖，因此对结肠癌具有良好的治疗效果[6-7]。

SW480细胞是一种人类结肠腺癌细胞株，最初是从1例50岁男性的肠癌组织中分离而得，研究表明，SW480细胞具有以下特点：①高度恶性，SW480细胞具有高度的转移和浸润性，是一种典型的恶性肿瘤细胞。②易于培养，SW480细胞可以在体外培养，增殖迅速，适合进行细胞实验。③易于转染，SW480细胞对转染和转化病毒非常敏感，使其成为研究癌基因和肿瘤抑制基因的理想细胞模型[8-9]。

SW480细胞的快速增殖和易于转染等特点使其成为研究结肠癌和肿瘤生物学的理想细胞模型，归纳起来，SW480细胞在结肠癌研究中的应用主要体现在以下几个方面：①药物筛选，SW480细胞可以用于筛选针对结肠癌的药物，并评估其抑制肿瘤细胞增殖的效果[10]。②基因功能研究，SW480细胞对转染和转化病毒敏感，可以用于研究癌基因和肿瘤抑制基因的功能和相互作用。③信号通路研究，SW480细胞是Wnt/β-catenin通路过度激活的典型模型，可以用于研究该通路在结肠癌发生和发展中的作用。④肿瘤免疫学研究，SW480细胞可以用于研究肿瘤免疫学，包括研究肿瘤细胞的免疫逃逸机制和开发针对肿瘤的免疫治疗方法[11-12]。

银杏叶提取物是一种天然药物，已广泛应用于许多疾病的治疗。银杏叶提取物具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症和免疫调节等多种生物学活性，近年来临床发现[8]，银杏叶提取物对SW480细胞增殖有着很大的影响。归纳起来，银杏叶提取物主要通过以下几个方面对SW480细胞增殖发挥作用：①抑制细胞周期，银杏叶提取物可能通过抑制细胞周期来抑制SW480细胞的增殖。一项研究发现，银杏叶提取物可以抑制SW480细胞进入G2/M期，从而阻碍其细胞分裂和增殖。②诱导凋亡，银杏叶提取物可能通过诱导细胞凋亡来抑制SW480细胞的增殖。

孙小虎等[13]在其研究报道中称，银杏叶提取物可以通过调节Bax/Bcl-2比值来诱导SW480细胞的凋亡；也可抑制Wnt/β-catenin通路，Wnt/β-catenin通路在结肠癌的发生和发展中起着重要作用。

相关研究表明，银杏叶提取物可以通过抑制Wnt/β-catenin通路来抑制SW480细胞的增殖[14]。因此，银杏叶提取物能有效抑制结肠癌患者SW480细胞增殖，并且可能通过多种作用机制来发挥其生物学活性，同时，不同的浓度所产生的效果也各不相同，通常情况下是在400 mg/L以上时抑制效果最佳，本研究结果显示，在100、200、300、400、500 mg/L浓度银杏叶提取物处理后其吸光度持续下降，200、300、400、500mg/L浓度时的吸光度与空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），100、200、300、400、500 mg/L浓度银杏叶提取物处理后的抑制率持续升高，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），与以上结论相符，进一步证实了银杏叶提取物能有效抑制结肠癌患者SW480细胞增殖。

李灵等[15]表明，在400 ml/L浓度时，ROS通常可达到480 ng/μl左右，XIAP mRNA则可控制在3.5左右。在本次研究中，不同浓度下ROS、XIAP mRNA表达水平，差异有统计学意义（P＜0.05），分析其原因，ROS在细胞中发挥重要的生理功能，例如调节细胞增殖和凋亡等过程。然而，过量的ROS会导致细胞损伤和氧化应激，进而引发细胞死亡，在肿瘤细胞中，细胞内ROS水平的增加可以诱导细胞凋亡，并对肿瘤的发展产生抑制作用。XIAP是一种抑制细胞凋亡的关键蛋白质，能够与多种凋亡信号通路的关键蛋白相互作用，抑制细胞凋亡的进行。在肿瘤细胞中，XIAP的过度表达与抗凋亡能力的增强以及肿瘤细胞的耐药性相关。银杏叶提取物可以影响结肠癌SW480细胞中的ROS水平和XIAP信号通路。而银杏叶提取物的抗氧化特性则能够增加细胞内ROS的生成或抑制ROS的清除，从而破坏细胞内的平衡状态，诱导细胞凋亡的发生。此外，银杏叶提取物还能够下调XIAP的表达水平，减少其与凋亡信号通路关键蛋白的结合，从而解除对细胞凋亡的抑制作用，这一结论也与李灵等[15]所报道的结果相符。

综上所述，银杏叶提取物可对结肠癌SW480细胞的增殖表现为浓度和时间依赖性地抑制。