超声提取-椰壳炭纯化酸樱桃果皮原花青素工艺研究

李杰 周云法 沈晓宇

摘 要：本文对酸樱桃果皮原花青素的提取纯化工艺进行了研究。以酸樱桃加工副产物果皮为原料，采用超声提取-椰壳炭吸附法分离纯化原花青素，并以柱后液和洗脱液原花青素浓度为指标，考察吸附过程中椰壳炭的目数、上样浓度、上样流速以及解析过程中洗脱乙醇浓度、洗脱速度等影响因素。结果表明，最佳工艺条件为以50～70目椰壳炭进行吸附，上样浓度8 mg·mL-1，上样速度3 BV·h-1，以70%乙醇进行洗脱，洗脱速度2 BV·h-1。稳定性试验显示，酸樱桃果皮渣粗提物的原花青素含量由6.13%提高至21.22%，且回收率高达83%。

关键词：超声提取；椰壳炭；酸樱桃；原花青素

Abstract： The extraction and purification process of procyanidins from Prunus cerasus was studied in this paper. The by-product of Prunus cerasus in processing was used as raw material， and procyanidins were extracted by ultrasound and purified with coconut shell charcoal. With the concentration of procyanidins in effluent and eluent as evaluating indicator， the influencing factors were investigated， including charcoals particle size， sample concentration， sample flow rate during absorption as well as ethanol concentration and elution flow rate. The results showed that the optimal process conditions were adsorption with 50～70 mesh of coconut shell charcoal was used， with the sample concentration of 8 mg·mL-1 and sample rate of 3 BV·h-1， and eluted by 70% ethanol at the rate of 2 BV·h-1. Stability study indicates that purity of procyanidins in Prunus cerasus crude extract increased from 6.13% to 21.22%， with the recovery rate of 83%.

Keywords： ultrasonic extraction; coconut shell charcoal; Prunus cerasus; procyanidins

酸樱桃（Prunus cerasus）为蔷薇科李属植物，其果实味道酸甜，营养丰富，含有多种维生素和矿物质，还富含多糖、黄酮、有机酸、原花青素等多种活性物质，相比于甜樱桃有更高的药用价值，酸樱桃的营养成分受气候、地理、储存条件影响显著[1-2]。现代研究表明，酸樱桃中的花青苷和原花青素具有很好的抗氧化和抗炎症作用，并具有清除自由基、预防性血管疾病等多种药理作用。原花青素纯化的高性价比方法为大孔樹脂吸附洗脱法[3-5]，但此类方法往往存在塑化剂残留的情况，不利于食品安全。酸樱桃多用于制备浓缩汁，其加工副产物果皮渣往往被丢弃而造成浪费。

椰壳炭以优质椰子壳为原料，经系列生产工艺精加工而成，具有孔隙发达、吸附性能好、强度高、易再生、经济耐用等优点。本研究以酸樱桃加工过程中的副产物果皮渣为原料，采用超声提取-椰壳炭吸附法分离纯化原花青素[6-8]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸樱桃（产地波兰）果皮，宁波御坊堂生物科技有限公司；椰壳活性炭，木林森活性炭江苏有限公司；原花青素（UV≥95%），成都曼斯特生物科技有限公司；乙醇（分析级95%），南京盛庆和化工有限公司；甲醇（分析级99.5%），南京盛庆和化工有限公司；香草醛（分析级99%），上海源叶生物科技有限公司；浓盐酸（分析级37%），扬州市华富化工有限公司；蒸馏水，杭州娃哈哈集团有限公司。

1.2 仪器与设备

XSD-1500超声清洗机，张家港市鑫盛达超声科技有限公司；RE-52CS-1旋转蒸发仪，上海亚荣生物仪器厂；FD-A10N-50冷冻干燥机，冠森生物科技（上海）有限公司；TU-1800可见光分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 超声提取酸樱桃果皮渣中原花青素

准确称取一定量的酸樱桃果皮渣，按料液比1∶15（g∶mL）加入50%的乙醇溶液，50 ℃超声提取30 min[9-10]，提取2次，过滤合并，50 ℃以下减压浓缩，冷冻干燥得到原花青素粗提物，取样检测原花青素含量，粗提物用于制备上样液。

1.3.2 原花青素检测及计算方法

（1）原花青素标准曲线的绘制。精密称取原花青素标准品25.09 mg于25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度线，摇匀，作为储备液。分别精密量取0.5 mL、2.0 mL、4.0 mL、 6.0 mL和8.0 mL上述储备液至10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释定容得到不同浓度的标准品溶液。取各浓度的标准品溶液1 mL于试管中，加入6 mL香草醛-甲醇溶液（40 g·L-1）和

3 mL浓盐酸，充分混匀后在30 ℃水浴中避光静置

1 h，快速在500 nm处测定吸光值。以甲醇为空白组，以标准品溶液浓度（mg·mL-1）为横坐标，吸光值为纵坐标，得原花青素标准曲线，如图1所示。原花青素溶液在0.05～0.80 mg·mL-1线性关系良好。

（2）柱后液原花青素浓度测定。收集并精密量取椰壳炭柱后液的样品（上样流出液和乙醇洗脱液）4.0 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加入甲醇溶解，定容，按上述标准品溶液测定方法测定500 nm下的吸光值，计算柱后液样品中原花青素浓度（mg·mL-1）。

（3）提取物原花青素含量测定及计算。精密称取提取物样品适量，于100 mL棕色量瓶中，加入甲醇溶解，定容，按上述标准品溶液测定方法测定500 nm下的吸光值，按照标准曲线计算得到提取物中原花青素的浓度。

1.4 工艺优化试验

1.4.1 椰壳炭吸附原花青素性能研究

（1）椰壳炭的目数选择。称取4～8目、10～20目、30～40目、50～70目、80～200目的椰壳炭各50 g，装柱。精密称取以上原花青素粗提物用蒸馏水配制成10 mg·mL-1的样液上样，以上样流速为3 BV·h-1进行吸附，分段收集流出液，每段收集的流出液为1柱体积（Bed volume，BV），检测每段流出液中原花青素的浓度，根据流出液浓度变化，绘制椰壳炭吸附原花青素曲线，确定椰壳炭的最佳目数。

（2）上样浓度的选择。称取最优目数的椰炭50 g，装柱。上样浓度为4 mg·mL-1、6 mg·mL-1、8 mg·mL-1、10 mg·mL-1、12 mg·mL-1，以上样流速为3 BV·h-1进行吸附，同上分段收集流出液，绘制椰壳炭吸附原花青素曲线，确定最佳上样浓度。

（3）上样流速的选择。称取最优目数的椰壳炭50 g，装柱。精密称取以上粗提物用蒸馏水配制成10 mg·mL-1的样液上样，考虑到椰壳炭阻力，上样流速为2 BV·h-1、3 BV·h-1、4 BV·h-1进行吸附，同上分段收集流出液，绘制椰壳炭吸附原花青素曲线，确定最佳上样流速。

1.4.2 椰壳炭解析原花青素性能研究

（1）洗脱乙醇浓度的选择。优选最佳上样吸附条件，用50%、60%、70%、80%乙醇溶液进行洗脱，洗脱速度为3 BV·h-1，分段收集流出液，每段收集的流出液为1 BV，检测每段流出液中原花青素的浓度，根据流出液浓度变化，绘制原花青素解析曲线，确定最佳洗脱乙醇浓度。

（2）洗脱速度的选择。优选最佳上样吸附条件和洗脱浓度，对比洗脱速度1 BV·h-1、2 BV·h-1、3 BV·h-1、4 BV·h-1，同上分段收集流出液，绘制原花青素解析曲线，确定最佳洗脱速度。

1.4.3 椰壳炭吸附纯化原花青素稳定性研究

称取最佳目数椰壳炭50 g，装柱。称取原花青素冻干粗提物4.0 g，用蒸馏水配制成最佳上样浓度，采用最佳吸附解析工艺，分别收集每倍量段（BV）的洗脱液，分别检测各段原花青素浓度；洗脱液在50 ℃以下减压浓缩后，冷冻干燥得酸樱桃原花青素提取物，称重并检测计算原花青素含量，平行进行3次稳定性试验。

2 结果与分析

2.1 椰壳炭吸附原花青素结果

2.1.1 椰壳炭目数的选择

由图2可知，不同目数椰壳炭对原花青素溶液的吸附能力相差较大，其中4～8目及10～20目椰壳炭的前三段流出液的原花青素浓度都较高，填料未完全吸附上样液中的原花青素，出现了较多泄露。其中50～70目椰壳炭吸附效果接近于80～200目椰壳炭，考虑到椰壳炭成本及生产效率，优选50～70目椰壳炭。

2.1.2 上样浓度的选择

由图3可知，当上样浓度为10～12 mg·mL-1时，椰壳炭吸附流出液的在第一段的时候出现明显泄漏点，且泄露曲线上升较快。当上样浓度在4～8 mg·mL-1时，椰壳炭对原花青素吸附效果较好，第二段出现泄露点，考虑生产效率及原花青素回收率，优选最佳的上样浓度为8 mg·mL-1。

2.1.3 上样流速的选择

由图4可知，上样流速越慢，椰壳炭对原花青素吸附效果越好，其中2～3 BV·h-1的上样流速对原花青素的吸附效果明显优于4 BV·h-1，结合生产效率，优选的最佳的上样流速为3 BV·h-1。

2.2 椰壳炭解析原花青素结果

2.2.1 洗脱乙醇浓度的选择

洗脱过程要求尽可能提高原花青素的回收率，其中同一浓度洗脱液各段收集液的原花青素濃度及原花青素的纯度均有所差异，实际根据下游产品需求进行分类收集。由图5可知，洗脱至3～5 BV时，洗脱液浓度明显下降；第1～3 BV阶段，70%和80%乙醇浓度的洗脱液中原花青素浓度较高，考虑到原花青素的回收率，优选70%乙醇作为洗脱溶剂。

2.2.2 洗脱速度的选择

由图6可知，随着洗脱速度的上升，洗脱液浓度明显下降。洗脱速度为1～2 BV·h-1时，前段部分洗脱液的原花青素浓度较高，有利于制备高纯度原花青素，结合生产效率及原花青素的回收率情况，优选2 BV·h-1的洗脱速度。

2.3 椰壳炭吸附纯化原花青素稳定性研究

称取50～70目椰壳炭50 g，装柱约100 mL。称取原花青素冻干粗提物4.0 g，用蒸馏水配制成8 mg·mL-1，上样速度为3 BV·h-1，上样完毕后用70%乙醇洗脱，洗脱速度为2 BV·h-1，洗脱5 BV，检测上样液及每段洗脱液中原花青素浓度，做3组平行实验，结果如表1所示。

由表1可知，椰壳炭吸附纯化原花青素的稳定性良好。其中上样液原花青素浓度为0.49 mg·mL-1，计算得原花青素粗提物含量为6.13%，经椰壳炭纯化后原花青素含量可达21.12%，原花青素回收率达83%。

3 结论

采用超声提取-椰壳炭吸附法分离纯化酸樱桃果皮渣中原花青素，可有效解决酸樱桃浓缩汁生产过程中副产物果皮渣的浪费。研究显示，使用超声低温提取可最大限度地保留原花青素，且使用椰壳炭作为吸附剂来进行纯化，一方面可以克服大孔树脂等塑化剂的残留，另一方面降低了生产成本。研究表明使用椰壳炭纯化酸樱桃果皮中原花青素的最佳工艺为使用50～70目椰壳炭，上样浓度为8 mg·mL-1，上样速度为3 BV·h-1，洗脱乙醇浓度为70%乙醇，洗脱速度为2 BV·h-1。经过3批稳定性试验，酸樱桃果皮渣粗提物原花青素含量由6.13%提高至21.22%，且原花青素回收率高达83%。

本研究只初步考察了椰壳炭对酸樱桃果皮中原花青素的吸附与解析作用，并提供了原花青素的有效提纯方法。酸樱桃汁的制备副产物果皮渣在实际放大分离和纯化原青花素的过程中，应充分考虑椰壳炭柱压的影响。关于吸附柱串联或并联使用以减少上样液的泄露，并对椰壳炭的再生及重复利用应做更进一步的研究。

参考文献

[1]REPAJIC M，PUSKAR B，DUGALIC K，et al.Quality and sensory study of fresh sour cherry juices upon cultivar， growing area and weather conditions[J].Journal of food science，2019，84（11）：3264-3274.

[2]劉艳秋，刘榅博，闫运开，等.不同成熟度对酸樱桃贮藏特性的研究[J].北方园艺，2017（4）：116-119.

[3]马小琴，王晓敏，周凡.大孔吸附树脂法分离纯化葡萄籽中原花青素[J].食品研究与开发，2017，38（16）：54-57.

[4]赵文娟，宋扬，杨洪江.大孔吸附树脂纯化黑果枸杞中的原花青素[J].食品工业科技，2017，38（22）：189-194.

[5]刘景玲，张治海，李鑫，等.大孔树脂法分离纯化大血藤中原花青素[J].食品工业科技，2017，38（1）：112-115.

[6]王平，陶春妙，朱兴一.活性炭吸附法脱除茶叶提取液中咖啡因的工艺研究[J].浙江工业大学学报，2010，38（4）：360-364.

[7]张卓睿，孙广仁.酸樱桃中原花青素的分离与纯化[J].湖北农业科学，2012，51（4）：800-803.

[8]刘艳秋，孟庆繁，高文韬.酸樱桃果实中原花青素提取工艺的研究[J].湖北农业科学，2014，53（6）：1384-1387.

[9]吴玥霖，戴晶晶，曾凡骏.分光光度法测定原花青素平均聚合度的研究[J].食品与发酵科技，2009，45（2）：54-58.

[10]刘芳芳，鲁亚星，于帅，等.黑果腺肋花楸花青素的提取工艺及其稳定性[J].延边大学农学学报，2015，37（3）：196-201.