灵芝育种技术的研究进展

蔡 凌,贺黎铭,李 芳,姚 珂,罗 霞

(四川省中医药科学院/菌类药材系统研究与开发实验室/中药材品质及创新中药研究四川省重点实验室,成都 610041)

灵芝又称神芝、仙草、瑞草,属于担子菌纲多孔菌科灵芝属,是一味传统的名贵中药。含有多糖(肽)、灵芝三萜等多种药用活性成分[1],具有抗肿瘤、降低血糖和血压、消炎、利尿、益胃、提高机体免疫力等多种功效[2],在中医药界享有极高的美誉。近年来,科研人员在灵芝育种方面取得了一些进展,文章概述了灵芝选择育种、诱变育种、原生质体融合育种、基因工程育种等育种技术的研究和应用,以期为灵芝育种工作提供参考。

1 选择育种

灵芝选择育种是从野生灵芝子实体中分离获得菌丝体,经过栽培驯化试验,筛选获得优良菌种的方法,在灵芝育种工作中广泛采用。陈体强等[3-4]通过驯化福建野生紫芝,成功获得2个适于推广栽培的菌株“紫S2(黑)”“闽紫96”。兰玉菲等[5]以泰山野生种驯化选育成具有产量高,出芝整齐等特点的灵芝新品种“泰山赤灵芝1号”。唐明先等[6]从野生藏灵芝菌株中驯化培育而成灵芝新品“康定灵芝”,该菌株出芝整齐、农艺性状稳定。林兴生等[7]从南非夸祖鲁纳塔尔省采集的野生灵芝经驯化培育而成形状好,产量高,有效活性成分高的灵芝新品种“南GL11”。

2 诱变育种

灵芝诱变育种可采用物理诱变(紫外线等)、化学诱变(氯化锂、甲基磺酸乙酯等)、太空环境、离子束注入诱变方法处理孢子、菌丝体、原生质体,提高发生基因突变频率,在较短的时间内获得较多的优良变异类型。

2.1 紫外诱变

灵芝进行紫外诱变育种通常选用10～30W功率的紫外灯,诱照距离在20～45cm区间,诱照时间为30～120s,采用的材料包括组织块、孢子悬浮液、菌丝体、原生质体。张伦等[8]采用紫外灯对野生灵芝组织块进行诱照120s,2d后再对刚萌发的菌丝进行第2次诱照处理,筛选获得了多孢灵芝菌株,产孢量从3.78%提升至8.48%。罗立新等[9]利用紫外灯对灵芝孢子悬浮液进行60s诱照处理,选育出高产菌株UV-60S,其菌体干重达13.1g/L,粗多糖含量为640mg/L,分别比原菌株提高了21.3%和30.6%。张帅等[10]利用20W紫外灯照射灵芝菌种琼脂块10min,发现灵芝菌丝体多糖含量可达 9.57%,比未经紫外照射的灵芝菌丝体多糖含量提高了 3.45%。余昭玮[11]利用20W紫外灯,20cm距离照射灵芝菌丝体悬浮液30s,发现诱变株液态发酵所得菌丝干重、菌丝多糖、胞外多糖与原始菌株相比分别提高了 16.1%、15.5%、18.0%。朱芬等[12]选择15W紫外灯,30cm距离诱照原生质体30s,获得了菌丝干重和三萜含量稳定提高的诱变株UV-3,分别比出发菌株高58.6%和29.4%。孙金旭等[13]利用20W紫外灯,距离40cm照射原生质体60s,获得了菌体产量相对提高38.71%,多糖产量相对提高79.16%的高产突变株Hs-26。董玉玮等[14]选择15W紫外灯,距离30cm照射原生质体30s,选育出3株高产有机锗诱变赤灵芝菌株,有机锗含量分别比出发菌株提高了113.58%、105.87%、103.86%。刘月芹等[15]用功率为10W的紫外灯,距离20cm照射原生质体30s,筛选出能在37℃高温下生长的灵芝新菌株。

2.2 化学诱变

灵芝化学诱变常用的诱变剂包括氯化锂、甲基磺酸乙酯、亚硝酸钠等。其中氯化锂在提升锗含量、胞内、胞外三萜方面较紫外诱变效果更佳、在提升胞外多糖产量较甲基磺酸乙酯、亚硝酸效果更佳。董玉玮等[16]采用氯化锂诱变赤灵芝原生质体,发现经0.3%氯化锂诱变,诱变菌株锗含量比原发菌株提高了269.02%,胞内、胞外三萜类产量达到最高,比原菌株分别提高了461.72%和136.57%[17]。紫外诱变选育的高产有机锗菌株仅较出发菌株提高113.58%[14],多糖产量相对提高79.16%[14],三萜含量稳定提高29.4%[12]。董玉玮等[18]对比氯化锂、甲基磺酸乙酯、亚硝酸对灵芝原生质体诱变筛选胞外多糖产量,发现氯化锂最佳诱变剂量为0.03%,此时诱变株L31胞外多糖产量最高为19.99mg/mL,较原发菌株提高914.72%。EMS最佳诱变剂量为0.12%,此时诱变株E40胞外多糖产量最高为6.14mg/mL,较原发茵株提高211.68%。亚硝酸钠(0.25mL 1mo/l pH4.5的醋酸缓冲液,加入0.06mol/L的亚硝酸钠0.25mL)最佳诱变时间为15min,此时诱变株H48胞外多糖产量最高为10.13mg/mL,较原发菌株提高414.21%。3种诱变方式下,诱变株L31的胞外多糖产量最高,且遗传性状最稳定,第三、五、七、九代胞外多糖产量较原发菌株分别提高了738.58%、671.07%、683.25%、673.10%。QuanYL等[19]用浓度为0.1mol/L的亚硝酸钠对灵芝菌丝体进行诱变处理5min。得到了比原始菌丝生长能力更强的菌株。

2.3 太空诱变(航天)

灵芝太空诱变育种是将小试优选的出发菌株以木屑为基质发好菌丝填装入玻璃瓶,搭载返回式卫星或飞船进入太空,利用太空中微重力、太空辐射、弱地磁效用等综合因素复合效应影响,返回后经复壮培养,分离纯化,品比及稳定性试验获得优异菌株的方法。诱变菌株在产量、品质、抗性等方面综合表现优异。王振福等[20-21]观测搭载“961020”返地式卫星诱变的新菌株卫星灵芝2号,该菌株比对照菌株子实体产量提高75.3%,优级品率达到88.9%,发酵收率平均达到2.57%,纤维素酶活力提高33%,抑瘤作用差异显著,16种氨基酸含量均有显著提高。祁建军等[22-23]发现搭载我国“神舟1号”宇宙飞船诱变的灵芝Sh菌株,孢子粉多糖含量比对照增加79.7%。Sx菌株孢子粉腺苷含量比对照增加42%。张蕾等[24]以“仙芝1号”为出发菌株,搭载我国第二十一颗返回式卫星进行航天诱变,经高温栽培筛选出一株耐高温35℃以上,具有抗逆性强、孢子产量高、饱满度高等优良特性菌株“仙芝2号”[25]。

2.4 离子束注入诱变

灵芝离子束注入诱变采用低能N+离子注入和物理等离子体方式,其中物理等离子体包括介质阻挡放电低温等离子体(DBD-LTP)和常压室温等离子(ARTP),工作气体为氦。N+离子注入根据正突变率和存活率综合考虑注入剂量,根据选用材料的不同,选择注入能量15-20KeV之间,注入剂量1015～1016ions·cm-2之间。ARTP通氦气量在10slm左右,根据诱变时间选择致死率在90%左右时为最佳诱变条件。赵世光等[26]确定了低能 N+ 离子注入菌丝体,在注入能量 20KeV,注入剂量2.6×1015～3.9×1015ions·cm-2范围内可获得高比例正突变株。李颖颖等[27]确定了新鲜灵芝孢子进行低能 N+ 离子注入的适宜参数：注入剂量 1.25×1016ions·cm-2,注入能量 20KeV,靶室真空度10-3Pa,以 5s脉冲式注入,间隔为 15s,正突变率最高,出现孢子存活率峰值13.33%,选到了一株灵芝高产菌株GL1026,其灵芝子实体产量、多糖含量、三萜含量分别较对照菌株提高了15.94%、9.68%、17.60%。韦达等[28]运用介质阻挡放电低温等离子体在最优放电条件通入氦气,气流量为2L/min、电压15.6kV、电流1.8mA、放电频率1.8kHz、处理2.5min对灵芝原生质体进行诱变,筛选出菌丝体中纳米硒含量与出发菌株相比提高了约30%的突变菌株H10。余雯雯[29]采用ARTP对灵芝菌株(沪农1号)菌丝体进行诱变处理,氦气流量为10slm/s,诱变50s,致死率93%,获得菌丝产量及灵芝酸产量显著提高的ATP3菌株。李塬等[30]利用ARTP对其原生质体进行诱变处理,通气量9.8slm,处理12.88s,致死率90%,获得遗传稳定性良好,多糖产量提高268.57%的诱变菌株A-246。

2.5 复合诱变

灵芝复合诱变是指采用不同诱变组合,产生协同效应,以期提高发生基因突变频率,获得更多的优良变异类型。研究发现复合诱变在胞外多糖、三萜产量提高方面与单一化诱变相比不具优势,但在诱变高产漆酶菌株中应用较多。王淑珍等[31-32]将灵芝CL988菌株孢子悬浮液经60CO-γ射线与紫外线交替累积诱变,获得菌丝高长速灵芝菌株CjL990,通过过氧化物酶和酯酶同工酶的电泳分析结果表明灵芝CL988菌株和灵芝CJL990菌株在酶带条数RF值尚有差异,说明诱变灵芝菌株遗传基因有所改变。董玉玮等[33]分别采用紫外线+甲基磺酸乙酯、紫外线+氯化锂复合诱变灵芝原生质体,对高产胞外多糖的菌株进行了筛选。最佳诱变条件下,紫外线+氯化锂复合诱变所获得的胞外多糖产量较原始菌株提高57.87%,紫外线+甲基磺酸乙酯复合诱变提高49.75%。单一化学试剂诱变胞外多糖产量,0.03%氯化锂诱变株L31较原发菌株提高914.72%,0.12%EMS诱变株E40较原发茵株提高211.68%[18]。20W紫外灯,距离40cm,照射原生质体60s,诱变株Hs-26菌体多糖产量相对提高79.16%[13]。PengR等[36]用氯化锂和TritonX-100处理灵芝原生质体,三萜类化合物的含量比原菌株增加373.43%。0.3%氯化锂诱变菌株胞内、胞外三萜类产量达到最高,比原菌株分别提高了461.72%和136.57%[17]。赵世光等[26]采用多轮低能 N+ 离子注入灵芝菌丝体,获得了遗传性稳定的漆酶高产突变株 UIM-281,2次产漆酶活力峰值分别是出发菌株的1.7倍及 2.28倍,且产酶发酵周期相对缩短 24h。易小畅等[34]通过紫外线-亚硝基胍逐级诱变处理药用真菌红芝菌丝体片段,获得1株漆酶高产诱变菌株LYL263,其平均酶活力比出发菌株提高187%。刘晓丹等[35]利用紫外线-硫酸二乙酯逐级诱变树舌灵芝菌丝片段;获得漆酶活性提高63.3%高产突变株。

3 原生质体融合

灵芝原生质体融合育种技术包括种间自发融合和异种间诱导融合两种,将单一性状表现优异又互补的菌株进行遗传重组借以获得兼有双亲优异遗传性状的新材料。目前灵芝原生质体融合技术中应用最广是电融合和化学融合,聚乙二醇(PEG)是最常用的化学融合剂,添加钙离子有明显的促进作用。高陈合等[37]通过化学方法和电融合法对白芝和赤芝原生质体融合条件进行了研究,显示PEG浓度30%、CaCl20.02mol/L、融合时间30min、温度 30℃,融合率可达0.4%。交变电流频率 2MHz、电压 40V、直流脉冲脉幅10kV/cm、脉宽 25lUS、直流电压为500V,融合率可达40%。高明侠等[38]过电融合方法对生长速度快、产量高、多糖含量低的紫芝和多糖含量高、生长速度慢、产量低的赤芝进行原生质体融合。最佳条件直流脉冲强度10kv,脉冲间隙24 Us,脉冲次数3次/s时融合率为0.038%,获得了生物量和多糖产量均高于两亲本的菌株。王淑珍等[39]以获得弱木栓质化灵芝菌株为目的,在 PEG-Ca2+系统中诱导灵芝和糙皮侧耳原生质体融合,筛选到木栓质化程度大于糙皮侧耳,小于灵芝的融合菌株。全卫丰等[40]在 PEG-Ca2+系统中诱导高产菌株美大灵芝和富晒能力较强的菌株惠州灵芝原生质体融合,到了一株灵芝高产融合菌株RG1108,其灵芝子实体生物转化率、子实体和孢子粉中的硒含量分别较对照提高了18.48%、21.78%、16.19%。

4 杂交育种

灵芝杂交育种以原生质体单核化技术为基础,研究发现两种交配型单核菌株获得比例不同,不符合1∶1 的理论,有的亲本只找到1种交配型。杂交菌株存在显著的杂交优势,亲本不同对杂交子生物性状影响很大,亲本交配型对灵芝菌丝生长速度方面有一定的影响,但对灵芝液体发酵相关性状均无影响。对杂交菌株多糖含量和产量及遗传距离相关性分析表明,杂交菌株的优良性状与亲本的遗传距离没有正相关性。丛倩倩等[41]发现“泰山赤灵芝1号”,获得了两种交配型单核菌株,两种交配型分离比例为16∶5,“灵芝4895”和“野生灵芝2”均只获得了一种交配型单核菌株,三个灵芝菌株两种单核体的分离比例均不符合1∶1 的理论值。吴小平等[42]对5个亲本进行原生质体单核化,获得了7种不同交配型的单核菌株,有的亲本只找到1种交配型。林俊华等[43]以“广东赤芝”和“灵芝5.75”为亲本的3个杂交菌株研究发现,“杂交 1号”分别比亲本提早 22和3d出菇,产量比“广东赤芝”高 178.5%,比“灵芝 5.75”高 34.9%。“杂交 2号”的菌丝生长速度明显快于 2个亲本菌株,子实体三萜含量比“广东赤芝”高 198%,比“灵芝5.75”高121.2%。王天娇等[44]发现杂交菌株对底物的利用和三萜产物的合成与亲本菌体比较有较大的提高。刘方[45]发现杂交菌株的优良性状与亲本的遗传距离没有正相关性,杂交菌株30+2-7×24-7在多糖和产量方面存在显著的杂交优势。李睿等[46]应用RAPD,SRAP两种标记技术分析了24个灵芝菌株(4个亲本,10个杂交子,10个非亲本)的遗传多样性,发现4个亲本的遗传关系相对较远。相同亲本产生的杂交子与亲本的遗传距离是不同的。有一个相同亲本的不同组合产生的杂交子遗传距离可能较近,且都接近于相同亲本。杂交子表现出一定的杂种优势。在菌丝生长速度方面,9个杂交子表现超双亲。在液体发酵菌丝生物量方面,12个杂交子表现超双亲。在三萜含量方面,有2个杂交子表现超双亲。在粗多糖含量方面,2个杂交子表现超双亲。未筛选到四项指标都较高的杂交子。亲本不同对杂交子生物性状影响很大,亲本交配型对灵芝菌丝生长速度方面有一定的影响,但对灵芝液体发酵相关性状均无影响。相同亲本产生的杂交子三萜含量方面差异也很显著,且与亲本有一定的关系。这与遗传多样性分析结果相对应。

5 基因工程

灵芝常规基因转化方法有电击转化法,农杆菌转化法,PEG转化法,突破了亲和因子的限制,获得了目的基因在灵芝中的过表达,使育种更具有目的性。

朱文静等[47]以人参大片段DNA通过电击转化法转入灵芝原生质体中,发现菌丝体整齐且生长速度更快,灵芝酸含量增高的转化子。孙墨可等[48]通过PEG转化法,将启动子 GPD、终止子 NOS和目的基因免疫调节蛋白基因 LZ-8、潮霉素标记基因HygB构建的双 T-DNA表达载体 pSB13ONG—Lz8导入灵芝原生质体,获得了免疫调节蛋白基因LZ-8在灵芝中的过表达。李瑞勤等[49]利用农杆菌介导法将同源性基因pgm转化灵芝原生质体,发现在PGM过表达的重组型灵芝菌株中胞内多糖含量和胞外多糖量最高分别为21.02mg/100mg菌体和0.71g/L,分别比野生型菌株高9.1%和 39.2%。灵芝多糖生物合成途径中pgm、pgi基因转录水平表达量较野生型灵芝菌株处于上调状态,且多糖合成代谢中相关酶活性有显著提高。

6 展望

灵芝做为从古至今的养生佳品,2019年11月国家卫生健康委员会和国家市场监督管理总局颁布了将灵芝等9种物质按照既是食品又是中药材的物质管理,可以预见未来市场对于灵芝产品的需求也将会更加旺盛。人工栽培的灵芝作为野生灵芝的替代品,优良菌种是高产、优质的前提。综观灵芝各种育种方法,笔者认为每种育种技术都有突出的优势和特点,可根据选育目的和实验室条件进行选择。育种工作中会产生了大量待筛选菌株,筛选工作耗资、耗时,后期研究可围绕建立高通量的筛选方法,科学的育种手段配合高效的筛选技术,获得更多灵芝优质品种材料,促进灵芝产业进一步壮大,满足消费者日益增长的需求。