ctDNA检测在膀胱癌诊疗中应用的研究进展

刘厚先 虞随 姚立锋

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一。相关数据统计，美国2020 年膀胱癌新增发病81 400 例，居恶性肿瘤发病的第6 位；死亡17 980 例，居恶性肿瘤死亡的第8 位[1]。目前膀胱癌的诊断主要依靠膀胱镜活检、影像学检查、尿脱落细胞学检查，但这些检查方式均存在一定的不足。比如膀胱镜活检虽然是膀胱癌诊断的金标准，但属于有创检查，且由于膀胱癌的异质性，并不能满足肿瘤精准治疗的需要；而尿脱落细胞学检查虽然能直接寻找肿瘤存在的证据，但灵敏度偏低。因此，临床上亟需寻找一种非侵入性、成本较低、灵敏度和特异性较高的检测指标。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）具有非侵入性、操作简单、实时和可重复取样等优势，目前在肿瘤的诊断、治疗与预后等方面具有较大的潜质。因此，本文就ctDNA 检测在膀胱癌诊疗中应用的研究进展作一综述。

1 ctDNA 概述

循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）是存在于血液中的细胞外DNA，它既存在于在健康人的血液中，也存在于癌症患者以及其他疾病患者的血液中。ctDNA 属于cfDNA 的一种，是指由肿瘤细胞释放的带有肿瘤特异性遗传学改变的基因组片段[2]。它主要通过肿瘤细胞凋亡、坏死以及外分泌等途径将其特异的DNA 释放入血，并经过肝和肾排泄[3]。ctDNA 既来源于原发肿瘤，也可来源于远处转移肿瘤以及微转移等。ctDNA 具有以下生物学特征：（1）片段大小一般为170 bp；（2）半衰期短，＜2 h[4]，能实时反映肿瘤状态；（3）在血液中的含量较低，每毫升血浆样本中仅有几十拷贝的DNA；（4）血液中的ctDNA 含量通常与肿瘤类型、肿瘤负荷以及肿瘤分期有关，在血液中ctDNA占cfDNA 的比例为0.01%～50.00%不等[5]。研究表明，ctDNA 与肿瘤组织存在一致的特征性基因组，可全面反映肿瘤基因序列，如插入、缺失、拷贝数改变、点突变以及DNA 甲基化等[6]，在肿瘤的早期诊断、预后判断、用药指导以及随访观察中起着重要作用[7-9]。

2 ctDNA 检测方法

为了区分ctDNA 与野生型DNA，有必要识别和检测肿瘤碎片所携带的体细胞突变。随着近年来ctDNA研究的不断深入，各种ctDNA 检测技术被开发出来。ctDNA 的检测方法主要有PCR、磁珠乳液扩增法、微滴式数字聚合酶链反应（droplet digital PCR，ddPCR）、扩增阻滞突变系统聚合酶链反应（amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR）和二代测序（next generation sequencing，NGS）。

2.1 磁珠乳液扩增法 磁珠乳液扩增法是通过特异性引物将单个DNA 分子与油包水微乳液中相应的磁珠一一相连进行PCR 扩增，之后通过与特定的荧光等位基因探针杂交来确定与磁珠结合的DNA 的突变状态，再利用流式细胞技术探测荧光标记，以此检测血浆中突变DNA 水平[10]。

2.2 ddPCR ddPCR 是目前在膀胱癌诊断中应用较多的ctDNA 检测技术，是将含有DNA 的反应体系分成数万乃至十万个微滴，对每个微滴进行PCR 扩增，然后用微滴分析仪逐个识别微滴中的DNA，并根据微滴的荧光振幅判断有无目标DNA，之后通过阳性微滴的个数和比例得出目标DNA 序列的浓度[11]。该方法能够实现核酸浓度的绝对定量，灵敏度极高，能够从十万个野生型DNA 中检测到一个突变，但仅能检测先前已知的突变，且不能一次检测多种突变。Birkenkamp-Demtröder 等[12]设计了个性化ddPCR 检测方法检测膀胱癌患者肿瘤、血浆和尿液DNA 中的体细胞突变，结果显示能在野生型基因的6 000 个背景拷贝中检测出一个突变基因等位基因（＜0.02%）。

2.3 ARMS-PCR ARMS-PCR 是利用DNA 聚合酶缺少3'-5'外切酶活性的原理，在一定条件下，PCR 引物3'末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变设计适当的引物，通过PCR 直接达到区分突变型和野生型基因的目的[13]。该技术操作简单，灵敏度高，但是只能检测已知突变，对未知突变难以检测，而且假阳性率较高。

2.4 NGS NGS 采用边合成边测序的方法将数百万的DNA 分子同时进行测序，并能够检测出低频突变以及未知突变，具有更高的灵敏度。另外，NGS 还能对基因拷贝数变化、基因重排、基因融合等改变进行分析。与第一代Sanger 测序相比，NGS 有3 个主要优势，最突出的一个是高通量，使得测试数千个基因甚至整个基因组成为可能。此外，NGS 在低输入DNA的情况下，表现出更为出色的检测性能；在大规模并行测序中，NGS 也具有更优的成本效益。但是，NGS 对仪器设备的要求较高，数据处理分析较难，在监管问题、分析验证、能力测试和质量控制等方面仍然存在着许多挑战[14]。

3 ctDNA检测在膀胱癌诊疗中的应用

在膀胱癌患者的血浆和尿液中可以检测到突变DNA。在非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）患者中，ctDNA 的主要来源是尿液和血液，而多数研究是采集尿液样本进行的。在1991 年的一项研究中，Sidransky 等[15]通过对膀胱癌患者尿液ctDNA 的分析，发现了其可行性的证据，并从尿液沉渣中发现细胞中存在p53 基因突变。在本世纪初才开始对膀胱癌血浆和血清中ctDNA 的广泛研究。von Knobloch 等[16]、Utting 等[17]采用PCR 检测膀胱癌患者尿液、血清和血浆中DNA 的微卫星不稳定性，结果发现其不仅能在尿液中检测到，而且在血清和血浆中也能检测到。Togneri 等[18]比较了尿液DNA与cfDNA 的基因组概况，以及匹配的23 例特征明确的膀胱癌患者甲醛固定石蜡包埋的ctDNA，结果显示尿液DNA 对患者肿瘤具有高度代表性，可用于检测临床可操作的复发基因组畸变；且与尿细胞DNA 相比，从尿液提取的cfDNA 具有更高的肿瘤基因组负荷，能更好地检测关键基因组生物标志物（90%）。Ward 等[19]采用数字PCR 和NGS 分析120 例原发性膀胱癌患者和91 例经尿道电切术后膀胱癌患者的尿液DNA，并在70%的患者中检测到突变DNA。以下主要从ctDNA 检测在膀胱癌诊断、疗效评价、预后评估中的应用进行阐述。

3.1 诊断 NMIBC 的特点是疾病复发率和相关疾病进展率高。一般来说，高达50%的NMIBC 患者在5 年内出现肿瘤复发，20%～30%的患者可能进展为肌层浸润性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC）[20]。因此，早期明确诊断和危险分层十分重要，有助于优化治疗策略。Reinert 等[21]采用实时PCR 检测尿液标本中EOMES、HOXA9、POU4F2、TWIST1、VIM、ZNF154 基因甲基化水平，同时分析了184 例NMIBC 患者的390份尿液沉积物，结果显示能检测到6 种标志物的高甲基化（P＜0.01)，灵敏度和特异度分别为0.82～0.89 和0.94～1.00。Roperch 等[22]利用等位基因特异性PCR 结合HS3ST2、SLIT2 和SEPTIN9 基因的cfDNA 甲基化状态分析cfDNA 中FGFR3 基因突变状态，结果发现其与NMIBC 患者的危险分层高度相关，表明这可能是诊断和监测NMIBC 的一种有效策略；进一步作ROC 曲线分析发现，其诊断的灵敏度＞90%，AUC＞0.80。Kim等[23]采用实时定量PCR 检测尿液中拓扑异构酶2-α cfDNA 表达水平，结果显示膀胱癌患者尿液中拓扑异构酶2-α cfDNA 表达水平明显高于非癌症对照者和血尿患者（均P＜0.01）；ROC 曲线分析显示，膀胱癌、NMIBC 和MIBC 的AUC 分别为0.741、0.701 和0.838，其中NMIBC 的灵敏度为0.63，特异度为0.70，阳性预测值为0.48，阴性预测值为0.82，证明其可能是膀胱癌的潜在生物标志物。Qian 等[24]报道了1 例尿路上皮癌患者，通过NGS 检测ctDNA 发现了肺腺癌有关的突变，并且颈部淋巴结病理分析证实为肺腺癌。肺腺癌来源的病变对奥西美替尼反应良好，而尿路上皮癌则不起作用，表明ctDNA 分析可以更好地捕捉患者多原发肿瘤所蕴含的分子异质性，有助于多原发肿瘤的同步诊断。

3.2 疗效评价 血浆中ctDNA 水平与肿瘤负担有关，对某些治疗的反应与治疗样本ctDNA 水平有关，故早期病程样本的ctDNA 分析可用于检测免疫治疗的抗肿瘤反应。ctDNA 水平已被证明与免疫治疗的反应相关，这在转移性黑色素瘤[25]、结直肠癌[26]、非小细胞肺癌[27]已有相关报道。研究发现，相较于常规影像学检查，检测ctDNA 可以早期发现肿瘤负荷的变化，从而更早了解疾病进展，但作为一项新方法，仍需进一步完善肿瘤的疗效评价体系[28]。Yi 等[29]的一项前瞻性临床研究采集了125 例转移性乳腺癌患者的血浆样本，靶向捕获并测序了1 021 个基因，对ctDNA 的突变进行检测发现，样本中ctDNA 百分比与肿瘤负荷显著相关，进一步验证ctDNA 在肿瘤疗效评价中的价值。

Raja 等[30]通过ctDNA 来预测肺癌和膀胱癌患者经德瓦鲁单抗治疗后的生存率。在两个队列（队列一包含28 例非小细胞肺癌患者，队列二包含72 例非小细胞肺癌和29 例尿路上皮癌患者）中，使用靶向测序方法对ctDNA 中73 个基因的体细胞突变的变异等位基因频率（variation allele frequency，VAF）进行评估，结果发现VAF 在影像学检查提示改变前出现变化，6 周时VAF 减少的患者肿瘤体积明显缩小，无进展生存期和总生存期明显延长，提示ctDNA 的早期变化是一个有效的预测标志物，有助于确定对免疫疗法无反应的患者并指导联合治疗策略。Vandekerkhove 等[31]结合全外显子测序和靶向测序分析51 例侵袭性膀胱癌患者[包括14 例局限性肌肉浸润膀胱癌和37 例淋巴结和（或）远处转移患者]血浆样本的ctDNA，结果发现95%的患者TP53、RB1 或MDM2 发生异常改变，70%的患者存在影响染色质修饰剂如ARID1A 的突变或破坏重排；同时检测到MAPK/ERK 或PI3K/AKT/mTOR 通路的靶向改变，包括ERBB2 的扩增（占20%）和PIK3CA 的激活热点突变（占20%），提示ctDNA 分析有助于发病机制的研究与转移性膀胱癌治疗策略的指导。

3.3 预后评估 由于膀胱癌复发率高、进展快，故早期发现膀胱癌的复发与转移对该病的治疗与预后改善至关重要。ctDNA 作为基于DNA 的生物标志物，可以在治疗前和治疗期间进行监测来反映膀胱癌的复发与进展状态[32]。

Birkenkamp-Demtröder 等[12]回顾性分析12 例复发或进行性/转移性膀胱癌患者的377 份样本，首先使用NGS 识别每例患者切除的原发肿瘤组织中体细胞突变，随后用ddPCR 个性化检测肿瘤、血浆和尿液样本DNA 中的体细胞变异，并在每例患者疾病进展的多个时间点进行检测，结果显示最终显示临床进展的6 例患者中，有4 例在临床显示前测到了ctDNA；进展性疾病患者在疾病进展前血浆和尿液样本中的ctDNA 水平均明显高于疾病复发患者（P＜0.05）。此外，该研究在所有疾病进展患者的尿液样本中发现高水平的ctDNA，即使在没有检测到血浆ctDNA 的情况下也是如此。该研究结果提示在非侵袭性疾病患者的血浆和尿液样本中也能检测到ctDNA，尤其是在尿液样本中，当病情进展前即可检测到高水平的ctDNA。因此，基因组变异的个性化检测可能有助于疾病监测。

Christensen 等[33]在两个回顾性队列研究中应用非个性化ddPCR，其中一个队列包括363 例NMIBC 患者，另一个队列包括403 例接受膀胱癌根治术患者。该研究选择膀胱癌中最常见的突变基因（FGFR3、PIK3CA）并采用PCR 对两组患者血浆和尿液样本进行突变筛查，结果发现后期进展患者尿液样本中ctDNA 水平明显升高（P＜0.05）；Kaplan-Meier 生存曲线分析显示，尿液样本中ctDNA 水平较低的患者疾病进展风险低于ctDNA 水平较高的患者。在另一组行膀胱癌根治术的对列研究发现，术前尿液样本中ctDNA 水平高低与疾病复发无关（P＞0.05），而血浆样本中ctDNA 水平高低与疾病复发有关（P＜0.05）。因此，尿液和血浆中FGFR3、PIK3CA 突变DNA 检测，将有助于膀胱癌复发和进展的监测。Christensen 等[34]在2019 年发表的研究中使用全外显子检测68 例局限性晚期膀胱癌患者体细胞突变，并通过对656 份血浆（在诊断、化疗期间、膀胱切除术前和监测期间获得）DNA 的超深度测序来评估ctDNA，结果显示诊断时发现ctDNA 阳性的患者（即开始新辅助化疗前）总复发率为46%（11/24），仅3%（1/35）的ctDNA 阴性患者在研究过程中出现了复发；化疗后和膀胱切除术前发现ctDNA 阳性的患者总复发率为75%（6/8）；膀胱切除术后，ctDNA 能识别所有复发和转移的患者，且特异度达98%，其中ctDNA 阳性的患者总复发率为76%（13/17），ctDNA 阴性的患者总复发率为0（0/47）；ctDNA 诊断复发相较于影像学检查平均提前96 d。此外，对于治疗前或化疗期间ctDNA 阳性的患者，ctDNA 的动态变化与疾病复发有关（P＜0.05）。可见，化疗前ctDNA 检测是评估预后的重要生物标志物，而化疗期间ctDNA 水平变化能反映患者对治疗的反应以及预后情况；此外，ctDNA 识别术后疾病复发也具有较高的灵敏度和特异度。

在临床或影像学确认前，ctDNA 检测复发的潜力已在Patel 等[35]研究中得到证实。该研究从17 例接受新辅助化疗的MIBC 患者中收集液体活检样本248 份，包括血浆、尿细胞沉淀和尿上清液，然后使用标记的扩增子和浅层全基因组测序评估突变DNA 中的单核苷酸变异和拷贝数变化；结果显示在新辅助化疗前，在血浆、尿细胞沉淀和尿上清液中分别检测到35.3%、47.1%和52.9%的突变DNA，其中尿上清液中的突变DNA 水平较高（P＜0.05）；在新辅助化疗期间，特别在两个新辅助化疗周期前采集的样本中，83%（5/6）的复发患者中存在突变DNA，但在无复发患者中未检测到突变DNA（特异度1.00，灵敏度0.83），较影像学诊断进展提前243 d。此外，突变DNA 的持续性检测可预测疾病复发（P＜0.05），显示了ctDNA 作为化疗反应早期生物标志物的潜力。另有文献报道，结直肠癌和膀胱癌患者的手术创伤与cfDNA 水平升高有关，可能会降低血液样本中ctDNA水平，并且会持续4 周，从而影响复发患者ctDNA 的检出[36]。因此，该研究建议在提取术后血液样本作ctDNA 检测时，应仔细考虑抽血时间，避免手术创伤引起的野生型cfDNA 污染的问题。

综上所述，ctDNA 检测用于膀胱癌早期危险分层、疗效和早期复发的评估是可行的，以指导早期治疗干预措施的制定与实施。

4 小结

ctDNA 检测是一种非侵入性检查方法，不仅能满足临床对实时性、连续性取材的要求，捕捉到肿瘤的异质性，避免组织活检的取样偏差，而且可识别最小残留或隐匿性肿瘤疾病，较目前标准的影像学检查具有更高的灵敏度，患者也易于接受，目前已越来越多应用于临床。ctDNA 检测在膀胱癌诊疗中的应用有助于早期筛查肿瘤，评估肿瘤分期和转移风险，预测和监测临床癌症治疗效果，追踪耐药性机制，为治疗干预提供信息，还能监测肿瘤早期转移和复发。然而，ctDNA 检测在临床应用中也存在许多挑战：（1）NGS、PCR 等技术检测的灵敏度仍然不足以应用于临床，特别是非肌层浸润性膀胱癌患者，ctDNA 检出率较低；（2）ctDNA 检测成本较高，特别是NGS，不适合用于疾病的早期筛查；（3）样本采集、实验规范性、基因检测仪器、生物学因素（如肿瘤异质性）等均会对ctDNA 检测结果产生影响，目前尚缺乏统一的标准流程；（4）目前尚缺乏大规模临床前瞻性研究证实ctDNA 检测在膀胱癌诊疗中的应用潜力。但是随着ctDNA 检测技术的进一步完善，有望在临床广泛应用。