滇黄精及其炮制品中皂苷类成分的薄层色谱研究

2023-09-03戴万生彭凯邱斌贺森顾雯

中国民族民间医药·上半月 2023年8期

戴万生彭凯邱斌贺森顾雯

【摘要】目的：建立滇黄精及其炮制品的薄层色谱鉴别方法，考查滇黄精炮制前后皂苷类成分的变化差异。方法：在《中国药典》2020版黄精薄层色谱法的基础上，对供试液的提取方法、展开剂比例、饱和时间、点样量等进行考察，并对滇黄精不同炮制品进行薄层分析。结果：优化方法为水饱和正丁醇超声提取总皂苷，以石油醚（60～90 ℃）∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸（5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8）展开，饱和时间为10 min，点样量为6 μL，5%香草醛硫酸溶液显色。黄精炮制后皂苷类成分产生一定变化。结论：本鉴别方法简单、快捷、分离效果好、斑点清晰，可用于滇黄精及其炮制品的鉴别。

【关键词】滇黄精；炮制品；总皂苷；薄层色谱

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2023）15-0029-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202315007

Abstract：Objective To establish a TLC method for the identification of Polygonatum kingianum and its processed products， and to investigate the changes of saponins in Polygonatum kingianum before and after processing.Methods On the basis of TLC of Rhizoma Polygonati in Chinese Pharmacopoeia 2020， the extraction method， developing agent ratio， saturation time， the amount of sample， etc. of the test solution were investigated， and the different processed products of Polygonatum kingianum. were analyzed by TLC. Results The optimized method was water saturated n-butanol ultrasonic extraction of total saponins，and developed with petroleum ether （60-90 ℃）： ethyl acetate： formic acid （5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8）. The saturation time was 10min， the amount of sample was 6 μL， and the color was developed with 5% vanillin sulfuric acid solution. After processing， saponins of Polygonatum kingianum produced certain changes. Conclusion The identification method is simple， rapid， with good separation effect and clear spots， which can be used to identify Polygonatum kingianum and its processed products.

Keywords：Polygonatum kingianum; Processed Products; Total Saponins; Thin Layer Chromatography

黃精为百合科黄精属植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricum Red.或多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua.的干燥根茎。按形状不同，习称“大黄精”“鸡头黄精”“姜形黄精”［1］。中医认为，黄精味甘、性平，归脾、肺、肾经。具有养阴润肺、补脾益气、滋肾填精的功效，常用于肺阴亏虚所致的干咳痰少、胸中隐痛，肾阴不足所致的腰膝酸软、头晕乏力，脾胃亏虚所致的纳差食少等。黄精生用具麻味，刺人咽喉，故多蒸后入药，蒸后可增强补脾润肺益肾的功效，并可消除其麻味，减轻对咽喉的刺激。现代研究［2］表明，黄精含有黄精多糖、低聚糖、甾体皂苷、黄酮等多种化学成分，具有抗衰老、降血糖、降血脂、防动脉粥样硬化、提高和改善记忆等广泛的作用。《中国药典》［1］收载的黄精薄层鉴别，药材和饮片相同，与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，但存在拖尾和斑点不够清晰；亦有文献［3-5］报道采用黄精皂苷元的薄层鉴别，分离效果较好且斑点清晰，可作为黄精的定性鉴别，但不能反映黄精及其炮制品的区别，黄精皂苷类成分为其主要有效成分之一，理论上加热会产生一定的水解反应，从而产生药性和药理的变化。南北朝雷斅著《雷公炮炙论》首次记载黄精为“蒸黄精”（凡采得，以溪水洗净后，蒸，从巳至子，刀薄切，曝干用），以后历代以九蒸九晒黄精为主，《中国药典》收载为酒黄精，云南炮制规范收载为炙黄精，主要区别在于所加辅料和蒸制时间的不同，炮制不加辅料或加黄酒、黑豆、蜂蜜等不同辅料，蒸制时间从几小时到几十小时不等，炮制是否“适度”无客观指标控制，其内在质量的差异难于判定［6-7］。因此本文以滇黄精为原料加工炮制为不同炮制品后，改进《中国药典》黄精薄层鉴别方法，建立滇黄精不同炮制品的皂苷类成分薄层鉴别方法，并对其进行色谱分析，为滇黄精炮制工艺和质量标准的制定提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 AR224CN型分析天平［奥豪斯仪器（常州）有限公司］；SK7210HP型超声波清洗器（上海科导超声仪有限公司）；DK-98-IIA型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试药硅胶G（青岛海洋化工有限公司，批号：20170915）；薯蓣皂苷元对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：S102115-79-7）；5％香草醛硫酸试液［5 g香草醛加10%硫酸乙醇100 mL（无水乙醇）配制而成］；其余化学试剂均为分析纯。黄精采自云南禄丰，经邱斌教授鉴定为滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.的根茎。

2 方法与结果

2.1 样品的炮制［1，8-9］

2.1.1 生黄精取鲜黄精，去除杂质，洗净，置沸水中煮15 min，取出，放凉，切3～4 mm厚片，60 ℃干燥，得生黄精片，粉碎，过60目筛，备用。

2.1.2 蒸黄精取鲜黄精，去除杂质，洗净，置蒸制容器内蒸14 h，取出，切3～4 mm厚片，60 ℃干燥，得蒸黄精，粉碎，过60目筛，备用。

2.1.3 酒黄精取生黄精片，适宜的容器内，加20％黄酒及适量（100%）水拌匀，浸润过夜，置蒸制容器内蒸12 h，闷润12 h，取出，60 ℃干燥，得酒黄精，粉碎，过60目筛，备用。每100 kg黄精，用黄酒20 kg。

2.1.4 炙黄精取生黄精片，置适宜的容器内，加入黑豆汁、蜂蜜、白酒及适量水（85%）拌匀，浸润过夜，置蒸制容器内蒸12 h，闷润12 h，取出，60 ℃干燥，得炙黄精，粉碎，过60目筛，备用。每100 kg黄精，用黑豆10 kg，蜂蜜5 kg，白酒5 kg。

2.1.5 九蒸九晒黄精取鲜黄精，去除杂质，洗净，置蒸制容器内蒸4 h，取出，60 ℃干燥4 h，如此反复9次，切3～4 mm厚片，取出，60 ℃干燥，得九蒸九晒黄精，粉碎，过60目筛，备用。

2.2 溶液制备方法

2.2.1 对照品溶液的制备取薯蓣皂苷元对照品适量，精密称定，制成浓度为0.06 mg/mL 的溶液，备用。

2.2.2 供试液的制备

2.2.2.1 甲醇超声提取法取黄精粉末10 g，置烧瓶中，加入15倍量甲醇，浸泡30 min，60 ℃超声提取50 min，过滤，按上法加入甲醇再提1次，合并滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇10 mL使溶解，备用。

2.2.2.2 乙醇提取正丁醇萃取法取黄精粉末10 g，加70%乙醇20 mL，加热回流1 h，过滤，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇10 mL使溶解，备用。

2.2.2.3 正丁醇超声提取法取黄精粉末10 g，置烧瓶中，加入15倍量水饱和正丁醇，浸泡30 min，60 ℃超声提取50 min，提取2次，合并滤液，减压浓缩回收溶剂至干，残渣加甲醇10 mL使溶解，备用。

2.3 供试液提取方法的选择取2.2.2项下3种方法制得的供试液和薯蓣皂苷元对照品溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，点样量4μL，以石油醚（60～90 ℃）∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸（5∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]0.5））为展开剂，将展开剂倒于展缸中饱和30 min，薄层板饱和30 min后展开，展距8 cm左右，取出，晾干，用5%香草醛硫酸溶液显色。结果：正丁醇超声提取法，分离较好，斑点清晰，效果最好。因此，按正丁醇超声提取法制备供试液。见表1，如图1所示。

2.4 色谱条件的优化

2.4.1 展开剂系统的优化展开系统优先考虑低毒性而采用药典所用展开系统，但多次预实验表明其分离效果不佳，故对其展开剂系统比例进行优化以期达到更好的分离效果。取生黄精、酒黄精、九蒸九晒黄精的正丁醇超声提取样液和对照品点于同一硅胶G薄层板上，点样量4 μL，以不同比例的石油醚（60～90 ℃）∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸展开系统①5∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]0.1；②5∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]0.5；③5∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]0.8；④5：1.5∶[KG-*3/5]0.8；⑤5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8展开，晾干，用5%香草醛硫酸溶液显色。结果：综合分离情况、Rf值大小、斑点数和清晰度，展开系统比例为5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8时效果较理想，故选用展开剂⑤为展开剂。如图2所示。

2.4.2 饱和时间的考察取对照品、生黄精、酒黄精、九蒸九晒黄精样液点于同一硅胶G薄层板上，点样量4 μL，展开系统：石油醚（60～90 ℃）∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸（5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8），饱和10 min、20 min、30 min后展开，晾干，用5%香草醛硫酸溶液显色。结果：饱和时间对展开效果影响不大，故选择饱和10 min为展开饱和时间。如图3所示。

2.4.3 点样量的考察分别取对照品与生品、酒制品、九蒸九晒品样液不同点样量2 μL、4 μL、6 μL点于同一硅胶G薄层板上，展开系统：石油醚（60～90 ℃）∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸（5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8），饱和10 min 展开后，晾干，用5%香草醛硫酸溶液显色。结果：点样量6 μL时，斑点比较清晰，故选择点样量为6 μL。如图4所示。

2.5 不同炮制品的薄层分析分别取对照品、生黄精、蒸黄精、酒黄精、炙黄精、九蒸九晒黄精样液6μL点于硅胶G薄层板上，展开系统∶[KG-*3/5]石油醚（60～90 ℃）∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸（5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8），饱和10 min 后展开，晾干，用5%香草醛硫酸溶液显色。结果：不同滇黄精炮制品分离效果好，共7个蓝色或蓝紫色斑点，Rf值分别为0.08、0.20、0.50、0.55、0.63、0.86和0.90。其中蒸黃精中Rf值为0.63的斑点明显较淡，九蒸九晒黄精中Rf值为0.08的斑点较大，且颜色与其它炮制品不一样。如图5所示。

3 结论与讨论

《中国药典》黄精薄层鉴别方法采用70%乙醇提取正丁醇萃取制备供试液，本文改用水饱和正丁醇超声提取更加简单、快捷，所得供试液杂质少、浓稠度低，色谱分离效果好、斑点更清晰（如图1）；对《中国药典》所用展开系统石油醚（60～90 ℃）∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸（5∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]0.1）与其它不同比例进行比较研究表明：展开系统比例为5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8时，分离效果、斑点数多，清晰度较理想（如图2）。

本实验中选用薯蓣皂苷元作为对照品主要考虑滇黄精中含有多种甾体皂苷以薯蓣皂苷为主，但实验中对照品薯蓣皂苷元斑点略低于滇黄精Rf值0.50的斑点，且颜色不一致，薯蓣皂苷元显黄色，而滇黄精Rf值0.50的斑点显蓝紫色，说明滇黄精及其炮制中薯蓣皂苷元含量较低。钟凌云等［10］研究亦表明黄精炮制后黄精中薯蓣皂苷元含量下降，薄层色谱斑点色泽与大小不同，其中生品斑点较大且颜色较深，而制品斑点较小且颜色较淡。实验说明滇黄精炮制后薯蓣皂苷转化为薯蓣皂苷元较少，可能主要为其它次生苷类成分。故薯蓣皂苷元不宜做为其薄层色谱分析的对照品，以暂用滇黄精对照药材为宜。此外，王倩等［11］报道滇黄精炮制过程中甾体皂苷转化成延龄草苷和薯蓣皂苷元，含量增大。其原因待于进一步研究。

有关滇黄精蒸制“时间”“适度”问题的讨论。雷斅首创黄精单蒸法炮制，蒸制间为14 h；孙思邈发展为“重蒸法”蒸制到“食之如蜜”，估算时间在十几小时至二十小时；后经孟诜建立“九蒸九曝”之法，直到清代九蒸九晒之法成为黄精炮制的主要方法，蒸制时间较长，不统一；现代，黄精以洒蒸法为主，蒸制时间在6～48 h。现行《药典》黄精质量标准中以黄精多糖为含量测定指标，问题是黄精多糖随蒸制时间的延长而降低，时间越长含量越低，这与黄精炮制后“增效”不符，所以饮片生产企业按药典含量指标要求炮制往往存在黄精炮制“不及”情况；另一方面，民间过度强调“九蒸九晒”，蒸制时间过长，易出现苦味和酸味等不良氣味，可能会降低其药性和功效。所以“适度”是炮制的基本原则。通过不同滇黄精的薄层色谱分析（如图5）发现：九蒸九晒黄精薄层色谱中出现一个较大的墨绿色斑点，证明滇黄精经过九蒸九晒后确实生成了新的成分，此斑点是否是滇黄精薯蓣皂苷转化生成的主要次生苷有必要进一步研究。笔者认为此斑点可视为滇黄精炮制由量变到质变的特征性斑点，可以做为滇黄精炮制是否“不及”的判定，后期实验笔者发现滇黄精蒸24 h时些斑点明显，故建立的滇黄精薄层鉴别方法可用于生、制滇黄精的鉴别。

《中国药典》采用的展开剂按比例配制后直接应用，调整比例后的展开剂需配制后分层取上层液应用。

参考文献

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