高毒力肺炎克雷伯菌的临床特征及分子流行病学研究

幸 运,袁其米,覃晓宇,鲁卫平,李 进,唐 霜

中国人民解放军陆军特色医学中心检验科,重庆 400042

肺炎克雷伯菌是医院及社区感染的重要条件致病菌,也是我国肠杆科细菌中排名第二的条件致病菌,近年来耐药性也不断上升[1]。在20世纪90年代,有研究报道了一种独特的社区获得性、组织侵袭性肺炎克雷伯菌感染的临床综合征,主要表现为化脓性肝脓肿,感染灶可出现在多个部位并可能发生转移性传播[2],临床上,该菌相比于经典肺炎克雷伯菌,感染性更强、转移程度更高、预后也较差,因此将其定义为高毒力肺炎克雷伯菌。高毒力肺炎克雷伯菌感染特征是其主要是社区获得性的,能感染任何年龄的健康个体,对抗菌药物敏感,且倾向于在感染后发生转移[3],肺炎克雷伯菌在高毒力和多重耐药基因上并没有重叠[4],即高毒力不一定高耐药。但随着抗菌药物的广泛使用及耐药质粒的传播,高毒力肺炎克雷伯菌耐药性不断提高,逐渐出现了碳青霉烯的耐药株,给临床治疗带来了极大的挑战,相关数据显示高毒力肺炎克雷伯菌可能正在逐渐代替经典肺炎克雷伯菌成为临床主要的致病类型[5]。因此,亟待进一步提高治疗质量,快速做出诊断,为临床治疗提供帮助,现报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集2021年1—3月本院住院及门诊132名患者临床分离的肺炎克雷伯菌145株,根据临床资料剔除同一患者同一部位菌种,其中高毒力肺炎克雷伯菌56株,经典肺炎克雷伯菌89株。患者主要为中老年人,50岁以上患者人数116人(占80.0%),最小患者年龄为11岁。

1.2仪器与试剂 台式高速冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific公司,型号ST8R)、IKA干浴锅、混匀器(型号Votex3)、赛多利斯电子天秤(型号BSA223S)、 PCR仪(Applied Biosystems公司,型号2720)、BIO-RAD化学发光成像系统(型号ChemiDoc XRS+)、BIO-RAD电泳仪。引物由北京六合华大基因有限公司合成,其他试剂包括核酸染料(北京鼎盛生物有限公司)、BBI琼脂糖粉、DL2000 DNA 标志物、GoTaq®Green Master Mix、无菌水。

1.3方法

1.3.1细菌核酸提取 145株细菌转种血平板,37 ℃培养24 h后,选取拉丝试验阳性的菌种;即用接种环在血平板上垂直向上挑起1～2个菌苔,若有拉丝,其拉丝长度≥5 mm的菌种为拉丝试验阳性[6]。本实验提取核酸的方法是煮沸法。用接种环刮取1～2环菌苔加入约150 μL无菌水中,混匀,100 ℃煮沸10 min,及时取出,在12 000 r/min,4 ℃离心10 min,分离取出上清,提取的核酸-20 ℃保存备用。

1.3.2细菌核酸扩增 本实验采用PCR对细菌核酸进行扩增。PCR设置条件:95 ℃预变性2 min,72 ℃变性15 s,55 ℃退火15 s,30次循环,72 ℃延伸5 min,4 ℃保持。PCR反应体系:总体积25.0 μL,2×TaqFrogga Mix 12.5 μL,上游引物1.0 μL,下游引物1.0 μL,DNA模板1.5 μL,无菌水9.0 μL。本实验各引物、产物长度和PCR条件见表1。

表1 各基因引物、产物大小、PCR反应条件

1.3.3琼脂糖凝胶电泳 缓冲液为0.5×TBE,琼脂凝胶配比为0.5 g琼脂糖粉加入到50 mL预配缓冲液,在微波炉中加热,每分钟旋转1次,直至琼脂糖完全溶解。冷却一段时间后向其中加入核酸染料0.5 μL,轻轻混匀,避免产生气泡。冷却至60 ℃,准备好凝胶托盘以倒入凝胶,使其在凝固前不会流出,将梳子置于凹槽中,并将托盘置于平坦水平位置。慢慢倒入琼脂糖溶液,使其均匀地分布在托盘内,在室温下固化。取出梳子,将凝胶转移到电泳槽,加入0.5×TBE缓冲液,直到凝胶被缓冲液覆盖。用移液枪将扩增产物及DNA 标志物加入孔中,上样量均为0.5 μL,盖上电泳槽盖,连接电源,调整电压120 V,电泳时间为30 min。电泳完毕将凝胶转移至凝胶成像仪,获取凝胶图像,DNA 标志物及阳性样本可显示有亮带。

1.4统计学处理 采用WHONET 5.6软件对菌株的临床分布和耐药特征进行统计分析。

2 结 果

2.1高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因阳性率比较 收集的145株菌种中初筛阳性的高毒力肺炎克雷伯菌56 株,阳性率为38.62%(56/145),经典肺炎克雷伯菌89株经典肺炎克雷伯菌,阳性率为61.38%(89/145)。对56株初筛阳性的高毒力肺炎克雷伯菌核酸扩增和凝胶电泳,检测结果显示,56株初筛阳性菌株中,iucA基因阳性菌53株(94.64%),iroB基因阳性菌54株(96.42%),terB基因阳性菌51株(91.07%),peg-344基因阳性菌55株(98.21%),peg-589基因阳性菌51株(91.07%),p-rmpA基因阳性菌51株(91.07%),p-rmpA2基因阳性菌51株(91.07%),c-rmpA基因阳性菌仅有4株(7.14%)。除c-rmpA外,其余高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因阳性率均在90%以上,peg-344阳性率最高,为98.21%。同一基因两种引物的结果相关性也较为明显,见图1。

图1 高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因阳性率比较

2.2菌株标本来源 145株菌株标本主要分离自痰液91株,其次为尿液15株、血液12株、分泌物8株、脓液7株、灌洗液6株、胆汁3株、腹水2株、脑脊液1株。

2.3菌株感染患者年龄段分布 145株菌株感染患者年龄分布依次为11～<20岁 1人(占0.69%),20～<30岁6人(占4.14%),30～<40岁8人(占5.51%),40～<50岁14人(占9.66%),50～<60岁35人(占24.14%),60～<70岁44人(占30.34%),70～<80岁27人(占18.62%),80～<90岁5人(占3.45%),≥90岁5人(占3.45%),其中60～<70岁患者人数最多,11～<20岁患者人数最少,50岁以上患者人数明显增多。

2.4菌株来源科室分布情况 145株菌株来源于24个科室,菌株来源最多科室是重症监护室,其次是神经外科、神内科监护室和胸外科。见表2。

表2 菌株来源科室分布情况

2.5经典肺炎克雷伯菌与高毒力肺炎克雷伯菌耐药率比较 89株经典肺炎克雷伯菌与56株高毒力肺炎克雷伯菌耐药性分析见表3。克雷伯菌属对氨苄西林和替卡西林天然耐药,因此未在表3中列出。

表3 经典肺炎克雷伯菌与高毒力肺炎克雷伯菌耐药率比较[n(%)]

3 讨 论

高毒力肺炎克雷伯菌已经被报道多年,但高毒力肺炎克雷伯菌并无统一明确的定义,在对其进行划分时也有多种不同的分类方法,目前分类方法如下:(1)基于临床特征的分类,即造成严重感染如肝脓肿、脑膜炎、肺炎等;(2)基于细菌学表型的分类,高毒力肺炎克雷伯菌的细菌学特征之一是其具有高黏液表型[7],这种特征表现在拉丝试验阳性,即用用接种环竖直向上轻轻挑起单个菌落,若挑起的黏液丝长度≥ 5 mm,则为拉丝试验阳性,称其为具有高黏液表型,在血琼脂平板上,高毒力肺炎克雷伯菌通常呈高黏稠性,并与邻近菌株相互融合[8],但其在发病率低的地区,高黏液表型的特异性并不高,因此学者们更多地把它作为一种初筛方法,也是最为简便的方法;(3)基于细菌标志物的定义,研究发现高毒力肺炎克雷伯菌存在一种毒力质粒 PLVPK,可编码一系列毒力相关因子,缺乏该质粒可导致高毒力肺炎克雷伯菌菌株毒力降低[9],可用于分类高毒力肺炎克雷伯菌,但对于怎么进行分类,用哪些毒力基因进行分类,尚无明确定义,不过针对此分类,可以用于研究快速检测高毒力肺炎克雷伯菌核酸的方法,可以不需借助临床特征判断是否是高毒力肺炎克雷伯菌,应用范围较广[10]。

目前研究发现,高毒力肺炎克雷伯菌相对于经典肺炎克雷伯菌,具有更强的毒力和致病力,高毒力肺炎克雷伯菌在全球范围内都有病例出现[11]。冯相铭等[12]对广东省102株肺炎克雷伯菌临床分离株病原特征分析发现,47.06%为高毒力肺炎克雷伯菌。有研究报道,导致患者血流感染、肺部感染及腹腔感染的230株肺炎克雷伯菌的多中心研究发现,37.8%为高毒力肺炎克雷伯菌[13]。本院初筛阳性的高毒力肺炎克雷伯菌56 株,阳性率为38.62%,与上述报道比例吻合。

89株经典肺炎克雷伯菌与56株高毒力肺炎克雷伯菌耐药性分析结果显示,两者对β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类耐药性较高;具体比较而言,氨基糖苷类(庆大霉素)的耐药率(14.6%vs.31.5%);喹诺酮类(左氧氟沙星)的耐药率(14.3%vs.29.2%);头孢类的耐药率[头孢他啶(17.9%vs.31.5%)、头孢曲松(19.6%vs.44.9%)、头孢吡肟(10.7%vs.42.7%)]。高毒力肺炎克雷伯菌与经典肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类(亚胺培南)抗菌药物较为敏感,耐药率分别为3.6%和27.0%,可以看出此类抗菌药物高毒力肺炎克雷伯菌耐药率明显较低。2021年全国细菌耐药监测网数据显示肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药率为23.4%[14],与此数据比较,本院肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药率17.9%(26/145)低于相关报道结果,这与本院结合病情合理利用抗菌药物,以及采取限制超广谱抗菌药物的经验用药等策略有关。

本研究结果显示,50岁以上患者人数明显增多,可以认为中老年人更容易感染肺炎克雷伯菌,而且菌株来源最多科室是重症监护室,肺炎克雷伯菌在重症患者中更为常见,可能与患者收治时间长、病情危重,抗菌药物使用的剂量较大相关;而患者标本的采集部位,62.76%来自痰液,痰液是相对简便的采集标本的方式,对于细菌检查十分重要,痰液标本占比较高也说明与肺炎克雷伯菌定植呼吸道有关[15]。

虽然有研究表明,肺炎克雷伯菌多重耐药与高毒力并不存在联系,即高毒力肺炎克雷伯菌虽然具有高致病力但对抗菌药物的耐药性并不高,推测有可能是因高毒力肺炎克雷伯菌菌株不能获得相关的耐药质粒,或者某些耐药基因在菌株转变为高毒力菌株过程中丢失[16];经典肺炎克雷伯菌致病力相对不高,但因其耐药基因携带率高使得对抗菌药物敏感的概率增加,但随着抗菌药物的不断使用和耐药质粒的传播,高毒力肺炎克雷伯菌的耐药性不断提高,多重耐药在高毒力肺炎克雷伯菌中也有病例出现。有研究报道,碳青霉烯类抗菌药物是临床治疗多重耐药菌的重要手段,但随着抗菌药物的不合理使用,肺炎克雷伯菌对多种抗菌药物均出现了耐药[17]。因此,如何应对耐药性的提高,提高治疗质量和效率,如何合理的用药,对临床已经成为新的挑战。由于本研究的菌株数并不大,所得结果可能存在局限性和偶然性,后续可以收集更多样本进行进一步研究,也可以据毒力基因的检测对现有检测方法做出改进,提供更快速灵敏的检测方式。

综上所述,高毒力肺炎克雷伯菌在本院肺炎克雷伯菌的中比例并不低,数据也提示50岁以上中老年人感染肺炎克雷伯菌概率更大,并且重症患者中分离出的肺炎克雷伯菌比例较高,因此及时就诊治疗是预防高毒力肺炎克雷伯菌感染转移、病情加剧的重要方式。