缺氧诱导因子-1抑制剂与紫杉醇联合使用治疗大鼠卵巢癌的研究

李 欣,王 波,安仲武,李海英,薄维波,关 辉

连云港市东方医院检验科,江苏连云港 222000

机体的功能和生存依赖于细胞可获得的充足的氧气供应,动物在有氧状态下利用糖酵解、氧化磷酸化等途径来分解体内的糖。在这些过程中,氧被用作电子受体,低效的电子转移会导致氧物种的产生,电子逸出会导致超氧阴离子和/或羟基自由基的产生,这些物质都被称为活性氧物质(ROS)[1]。研究表明,ROS的增加与电子传递链中生理氧分压的偏离有关[2]。因此,通过动态平衡机制严格调节细胞内氧浓度是非常必要的。所有实体肿瘤的特点都是缺氧,缺氧可通过病理性或非病理性条件在生物体中诱导应激,后果包括DNA链断裂、DNA氧化损伤以及阻碍细胞生长甚至细胞死亡[3]。缺氧诱导因子1(HIF-1)是一种异源二聚体蛋白,由缺氧诱导因子-1α(HIF-1ɑ)和缺氧诱导因子-1β(HIF-1β)两个亚基组成[4]。其中ɑ亚基为氧敏感亚基,受缺氧诱导因子脯氨酸羟化酶(PHD)的严格调控,PHD能够羟基化ɑ亚基上的特定脯氨酸残基,在缺氧过程中,PHD活性的降低稳定了HIF-1ɑ,导致其移位到细胞核,与HIF-1β 结合形成复合物,该复合体与含有缺氧反应元件的靶基因结合,激活不同信号通路的基因表达[5]。HIF-1可以被认为是一种信使,它向细胞核迁移,激活对缺氧的转录反应,参与肿瘤的转移、生长、发生、血管生成和侵袭等基因调控。在缺氧条件下,HIF-1α解离并在细胞内快速积聚,然后移位到细胞核内,并与HIF-1α调控基因启动子区域的缺氧反应元件结合。过表达的HIF-1α通过增强血管生成、侵袭和糖酵解等途径促进癌细胞存活。HIF-1α被认为是控制肿瘤生长和转移的重要因素,因此,抑制HIF-1α活性可能在癌症治疗中具有广泛的临床应用[6-7]。紫杉醇是一种天然抗癌物,它能够使微管蛋白和微管蛋白二聚体失去动态平衡,促进微管蛋白聚合,防止解聚,使微管稳定,从而抑制癌细胞的有丝分裂,触发癌细胞凋亡,进而有效阻止癌细胞的增殖,起到抗癌作用,目前在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌的治疗。LW6是新型的HIF-1抑制剂,抑制作用强,因此选取该抑制剂。本研究将常规紫杉醇化疗法与HIF-1抑制剂联合使用,观察其在荷实体瘤大鼠中的作用,以探讨两者联合使用是否更有利于阻止肿瘤的进展,为临床治疗肿瘤提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1实验动物及细胞 40只雌性SPF级SD大鼠,日龄30～35 d,体重100～120 g,由连云港市东方医院实验转化中心提供;卵巢癌NUTU-19细胞株购自上海美轩生物科技有限公司。

1.2主要试剂 紫杉醇注射液购自深圳万乐药业有限公司;HIF-1抑制剂LW6购自北京百奥莱博科技有限公司;TNF 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、HIF-1 ELISA试剂盒购自上海江莱实业股份有限公司;10%中性甲醛购自北京索莱宝科技有限公司;组织RNA提取试剂盒、cDNA反转录合成试剂盒及PCR反应液均购买于上海江莱实业股份有限公司。

1.3方法

1.3.1构建卵巢癌SD大鼠模型 将卵巢癌NUTU-19细胞进行培养,通过离心法收集细胞,将收集后的细胞用完全培养液重悬,密度调节至2×107个/mL。取40只雌性SPF级SD大鼠,于右侧腋窝皮下注射0.2 mL已预先准备好的人卵巢腺癌NUTU-19肿瘤细胞悬液(约含2×107个活细胞),皮肤隆起为注射有效。在结节形成后每天用游标卡尺记录其最长径(a)及最短径(b),待出现大鼠体重减轻、毛发干枯、活动能力下降,并且当右下腋窝处肿瘤大小成长到0.4 cm×0.4 cm时认为造模成功。

1.3.2分组及给药 取造模成功的SPF级SD大鼠40只,分4组,每组10只,分别为模型对照组、常规化疗组、HIF-1抑制剂组及联合治疗组,其中模型对照组腹腔注射生理盐水,每天注射2次,每次0.2 mL,连续注射4 d,间隔3 d后,再连续注射4 d;常规化疗组注射紫杉醇注射液,20 mg/kg,腹腔注射,每天注射2次,每次0.2 mL,连续注射4 d,间隔3 d后,再连续注射4 d;HIF-1抑制剂组注射HIF-1抑制剂LW6,2.5 mg/mL,腹腔注射,每次0.2 mL,连续注射4 d,间隔3 d后,再连续注射4 d;联合治疗组同时注射紫杉醇和LW6,紫杉醇及LW6给药剂量同上,腹腔注射,每天注射2次,每次0.2mL,连续注射4 d,间隔3 d后,再连续注射4 d。

1.3.3检测指标 (1)称重。停药后每天观察大鼠的精神状态,每隔2天称重1次,停药1周后,处死大鼠,分离肿瘤组织,对肿瘤的重量进行称重统计。(2)TNF及HIF-1检测。取肿瘤组织100 mg,按重量体积比加PBS 900 μL,通过研磨法制备成10%组织匀浆液,3 000 r/min,离心20 min,收集上清,冻存于-20 ℃冰箱备用,通过ELISA法检测肿瘤坏死因子(TNF)和HIF-1水平。(3)HE-4及CA125水平检测。心脏采血,收集血液,3 000 r/min,离心10 min,收集血清,保存到-20 ℃冰箱备用,通过化学发光法检测大鼠血清中HE4、CA125水平。(4)原癌基因细胞周期素D1(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原(PCNA)表达量的检测。按照试剂盒说明书进行操作,利用荧光定量PCR技术检测肿瘤组织中Cyclin D1、PCNA表达量。

2 结 果

2.1各组荷卵巢癌大鼠肿瘤重量比较 模型对照组荷卵巢癌大鼠肿瘤重量为(0.91±0.06)g,常规治疗组荷卵巢癌大鼠肿瘤重量为(0.68±0.03)g,HIF-1抑制剂组荷卵巢癌大鼠肿瘤重量为(0.49±0.03)g,联合治疗组荷卵巢癌大鼠肿瘤重量为(0.32±0.04)g,常规治疗组荷卵巢癌大鼠肿瘤重量明显低于模型对照组,差异有统计学意义(P<0.05);HIF-1抑制剂组及联合治疗组荷卵巢癌大鼠肿瘤重量明显低于常规治疗组及模型治疗组,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2两组肿瘤组织中 TNF及HIF-1水平比较 常规治疗组肿瘤组织中TNF 及HIF-1水平明显低于模型对照组,差异有统计学意义(P<0.05);HIF-1抑制剂组和联合治疗组肿瘤组织中TNF 及HIF-1水平明显低于模型对照组和常规治疗组,差异有统计学意义(P<0.05);联合治疗组肿瘤组织中TNF 及HIF-1水平显著低于HIF-1抑制剂组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组肿瘤组织中TNF、HIF-1水平比较

2.3各组大鼠血清中HE-4及CA125水平比较 常规治疗组大鼠血清中HE4及CA125水平明显低于模型对照组,HIF-1抑制剂组和联合治疗组HE4及CA125水平明显低于模型对照组和常规治疗组,差异有统计学意义(P<0.05);联合治疗组HE4及CA125水平明显低于HIF-1抑制剂组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清中HE4及CA125水平比较

2.4各组大鼠血清中 Cyclin D1 及PCNA表达量比较 联合治疗组Cyclin D1及PCNA表达量明显低于模型对照组及常规治疗组和HIF-1抑制剂组,差异有统计学意义(P<0.05);常规治疗组和HIF-1抑制剂组Cyclin D1 及PCNA表达量明显低于模型对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清中 Cyclin D1 及PCNA表达量比较

3 讨 论

卵巢癌目前是女性癌症相关死亡的第五大原因,卵巢癌在早期并无明显症状,当被确诊时多为中晚期,错过了治疗的最佳时间,因此病死率高[8]。由于确诊困难,使得治疗难度增加,因此需要在卵巢癌的治疗上寻求新的突破。

有研究表明,缺氧是实体瘤的共同特征,在肿瘤的恶性病变中有着至关重要的作用,在缺氧的状态下,HIF-1通过上调致癌基因的转录,在肿瘤细胞适应低氧和营养缺乏的条件中发挥关键作用,HIF-1的过表达促进了肿瘤的发生发展[9]。本研究结果表明,HIF-1抑制剂组及联合治疗组荷卵巢癌大鼠肿瘤重量明显低于模型组及常规治疗组,说明抑制HIF-1的表达,能够抑制卵巢癌的进展。联合治疗组荷卵巢癌大鼠肿瘤重量明显低于HIF-1抑制剂组,说明HIF-1抑制剂及紫杉醇的联合使用更有利于阻止卵巢癌的进展。

此外,本研究结果显示,常规治疗组肿瘤组织中HIF-1水平明显低于模型对照组,差异有统计学意义(P<0.05),说明在肿瘤组织中HIF-1确实过表达,HIF-1参与了肿瘤的发生发展。TNF 可通过与细胞膜表面的TNF受体直接结合介导对肿瘤细胞的直接杀伤作用、抑制肿瘤细胞生长或诱导肿瘤细胞凋亡,在肿瘤的发生发展中起着重要作用[10]。本研究常规治疗组肿瘤组织中TNF水平明显低于模型对照组,差异有统计学意义(P<0.05),说明随着卵巢癌的进展,TNF 水平逐步升高,与卵巢癌的发生、发展过程密切相关。HIF-1抑制剂组和联合治疗组肿瘤组织中TNF水平明显低于模型对照组和常规治疗组,差异有统计学意义(P<0.05),表明HIF-1抑制剂组及联合治疗组干预了卵巢癌的发病过程,能够抑制肿瘤组织的发生与发展。

HE4是参与精子成熟过程的蛋白酶抑制剂,有研究表明HE4在血清和组织中的高表达与多种癌症类型有关,这预示着HE4或许能够为临床诊断及治疗肿瘤提供参考[11]。CA125是肿瘤标志物糖类抗原之一,能够用于辅助诊断卵巢癌[12]。本研究卵巢癌模型大鼠HE4及CA125水平均呈高表达,抑制HIF-1的表达后,HE4及CA125水平显著降低,与紫杉醇联合使用后,大鼠血清中的HE4及CA125水平降低更为显著,表明抑制HIF-1的表达能够有效控制卵巢癌的进展,与紫杉醇联合使用后,对卵巢癌的发展有更明显的抑制作用。

有研究表明Cyclin D1及PCNA与卵巢癌进展直接相关,Cyclin D1能够加速癌细胞周期,PCNA能够加速DNA复制,共同促进细胞增殖[13]。本研究联合治疗组Cyclin D1及PCNA表达量明显低于其他3组,表明HIF-1抑制剂及紫杉醇的联合使用对肿瘤组织中的癌基因具有调控作用,能够减少原癌基因的表达,从而达到抑制肿瘤生长的目的。

综上所述,抑制HIF-1的表达能够抑制肿瘤的生长,降低肿瘤组织中TNF 的表达,降低大鼠血清中HE4及CA125水平,同时也降低了Cyclin D1 及PCNA的表达,而常规紫杉醇化疗法与HIF-1抑制剂联合使用,更有利于阻止卵巢癌的进展,可为临床治疗卵巢癌提供新的思路。