山牡荆不同部位提取物药效学评价研究

吕林艳 刘 洋 方彬又 郑志远 梁云飞 麦志雄　

山牡荆不同部位提取物药效学评价研究

吕林艳1,2刘 洋1,2方彬又1,2郑志远1,2梁云飞1,2麦志雄1,2

（1.广西梧州制药（集团）股份有限公司，广西 梧州 543000；2.广西天然药物现代制剂技术工程研究中心，广西 梧州 543000）

目的：评价山牡荆不同部位提取物的抗细菌性炎症及肾保护的作用。方法：以受精后3天的斑马鱼用于山牡荆样品抗细菌性炎症功效最大检测浓度测定及其功效评价；以受精后2天的斑马鱼用于肾保护功效最大检测浓度测定及其功效评价。结果：山牡荆枝叶、山牡荆果实和山牡荆根和心材对模型斑马鱼的MTC均为2000 μg/mL；山牡荆枝叶1000、2000 µg/mL浓度组，山牡荆果实1000 µg/mL浓度组，山牡荆根和心材500、1000、2000 µg/mL浓度组炎症部位的中性粒细胞数量较模型对照组减少，具有统计学差异。山牡荆枝叶、山牡荆果实和山牡荆根和心材的500、1000、2000 μg/mL浓度组中肾性水肿数量较模型对照组显著减少，具有统计学差异。结论：山牡荆枝叶、山牡荆果实和山牡荆根和心材均具有抗细菌性炎症、肾保护功效。

山牡荆；提取物；斑马鱼；细菌性炎症；肾保护

引言

山牡荆为马鞭草科植物山牡荆[(Lour.) Will]的干燥根和茎，全年均可采收，除去杂质，切段，晒干制成；具有止咳定喘、镇静退热的功效，临床用于急、慢性气管炎，支气管炎，咳喘，气促，小儿发热等[1]。文献研究表明山牡荆提取物对慢性肾炎模型大鼠的尿蛋白、血清肌酐、尿素氮、血脂水平均有明显的改善作用[2]。本文通过建立斑马鱼细菌性炎症模型和斑马鱼肾损伤模型，观察山牡荆枝叶、山牡荆果实和山牡荆根和心材提取物对炎症部位中性粒细胞数量、肾性水肿数量等的影响，为山牡荆抗炎和肾保护作用提供依据。

1 试验材料

1.1 试验样品

将山牡荆不同部位粉碎制成样品，取山牡荆枝叶（过3号筛，50目）527.4 g、山牡荆果实（过3号筛，50目）563.3 g、山牡荆根和心材（过3号筛，50目）525.1 g。药粉加5倍量纯化水提取，保持微沸30分钟，过滤，药渣加2～3倍量纯化水继续提取，保持微沸20分钟，过滤，合并两次提取液，加凉开水定量至5倍量（药粉），即得到200 mg/mL母液的试验样品，冷冻（-20 ℃）储存。

1.2 试验动物

试验用鱼为斑马鱼，由杭州环特生物科技股份有限公司提供，实验动物使用许可证号为SYXK（浙）2022-0004，饲养和管理符合国际AAALAC认证（认证编号：001458）的要求。

转基因中性粒细胞绿色荧光品系（MPX）斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后3天（3 dpf）的斑马鱼用于样品抗细菌性炎症功效最大检测浓度（MTC）测定及其功效评价。

野生型AB品系斑马鱼，同样以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后2天（2 dpf）的斑马鱼用于样品肾保护功效MTC测定及其功效评价。

1.3 仪器、耗材与试剂

试验仪器和耗材：电动聚焦连续变倍荧光显微镜（AZ100，Nikon，Japan）；解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，Japan）；CCD相机（VertA1，上海土森视觉科技有限公司，China）；显微注射仪（IM300，Narishige，Japan）；拉针仪（PC-10，Narishige，Japan）；精密电子天平（CP214，OHAUS，USA）；6孔板（Nest Biotech，China）。

试验试剂：脂多糖（LPS，批号12180309，Sigma，Israel）；乙酸地塞米松（批号B1828095，批号L1931006，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China）；二甲基亚砜（DMSO，批号20171016，国药集团化学试剂有限公司，China）；马兜铃酸A（批号WXBD0062V，Sigma，USA）；Dextran tetramethylrhodamine（批号923446，molecular probes，USA）；甲基纤维素（批号C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China）。

2 试验方法

2.1 抗细菌性炎症功效评价

2.1.1 MTC测定

试验在6孔板中进行，每孔定容标准稀释水后含量为3 mL，设置30尾/孔，试验用鱼为3 dpf转基因中性粒细胞绿色荧光品系（MPX）斑马鱼。设置正常对照组（标准稀释水处理组，即空白对照组）和模型对照组（显微注射LPS于斑马鱼卵黄囊建立细菌性炎症模型），并在细菌性炎症模型斑马鱼上分别水溶给予山牡荆枝叶、山牡荆果实、山牡荆根和心材（浓度见表1）。28℃条件下处理5 h后，测定山牡荆枝叶、山牡荆果实、山牡荆根和心材对模型斑马鱼的MTC。

2.1.2 抗炎功效评价

试验在6孔板中进行，每孔定容标准稀释水后含量为3 mL，设置30尾/孔，试验用鱼为3 dpf转基因中性粒细胞绿色荧光品系（MPX）斑马鱼。设置正常对照组（标准稀释水处理组，即空白对照组）和模型对照组（显微注射LPS于斑马鱼卵黄囊建立细菌性炎症模型），并在细菌性炎症模型斑马鱼上分别水溶给予山牡荆枝叶、山牡荆果实、山牡荆根和心材（浓度见表2），及阳性对照药乙酸地塞米松，浓度为32.6 μg/mL。28 ℃条件下处理5 h后，在荧光显微镜下拍照，每实验组随机选取10尾，用ImageJ v1.53k软件进行数据分析，分析炎症部位中性粒细胞数量，并评价山牡荆枝叶、山牡荆果实、山牡荆根和心材的抗细菌性炎症功效。

2.2 肾保护功效评价

2.2.1 MTC测定

试验在6孔板中进行，每孔定容标准稀释水后含量为3 mL，设置30尾/孔，试验用鱼为2 dpf野生型AB品系的斑马鱼。设置正常对照组（标准稀释水处理组，即空白对照组）和模型对照组（用马兜铃酸A水溶给予斑马鱼建立肾损伤模型），并在肾损伤模型斑马鱼上分别水溶给予山牡荆枝叶、山牡荆果实、山牡荆根和心材（浓度见表3）。28 ℃条件下处理2天后，测定山牡荆枝叶、山牡荆果实、山牡荆根和心材对模型斑马鱼的MTC。

2.2.2 肾保护功效评价（表型观察）

试验在6孔板中进行，每孔定容标准稀释水后含量为3 mL，设置30尾/孔，试验用鱼为2 dpf野生型AB品系斑马鱼。设置正常对照组（标准稀释水处理组，即空白对照组）和模型对照组（用马兜铃酸A水溶给予斑马鱼建立肾损伤模型），并在肾损伤模型斑马鱼上分别水溶给予山牡荆枝叶、山牡荆果实、山牡荆根和心材（浓度见表4），以及阳性对照药地塞米松，浓度为9.81 μg/mL。28 ℃条件下处理2天后，统计肾性水肿的发生率，并评价山牡荆枝叶、山牡荆果实、山牡荆根和心材的肾保护功效。

2.2.3 肾小球滤过促进功效评价

试验在6孔板中进行，每孔定容标准稀释水后含量为3 mL，设置30尾/孔，试验用鱼为2 dpf野生型AB品系斑马鱼。设置正常对照组（标准稀释水处理组，即空白对照组）和模型对照组（用马兜铃酸A水溶给予斑马鱼建立肾损伤模型），并在肾损伤模型斑马鱼上分别水溶给予山牡荆枝叶、山牡荆果实、山牡荆根和心材（浓度见表5），及阳性对照药地塞米松，浓度为9.81 μg/mL。28 ℃条件下处理1天后，将荧光标记物（Dextran tetramethylrhodamine）静脉注射给各实验组斑马鱼，继续处理1天后，在荧光显微镜下拍照，每实验组随机选取10尾，数据的采集和分析是利用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件，以斑马鱼体内残留的荧光强度评价山牡荆枝叶、山牡荆果实、山牡荆根和心材的肾保护功效。

2.3 数据分析

统计学的处理结果用mean±SE表示。用SPSS 26.0软件进行数据处理，＜0.05表明差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 抗细菌性炎症功效评价

3.1.1 MTC

在本实验条件下，山牡荆枝叶、山牡荆果实和山牡荆根和心材对模型斑马鱼的MTC均为2 000 μg/mL。详见表1。

表1 样品抗炎功效浓度摸索实验结果（n=30）

组别浓度/μg·mL-1死亡数/尾死亡率/%表型 正常对照组—00未见明显异常 模型对照组—00未见明显异常 山牡荆枝叶12500与模型对照组状态相似 25000与模型对照组状态相似 50000与模型对照组状态相似 1 00000与模型对照组状态相似 2 00000与模型对照组状态相似 山牡荆果实12500与模型对照组状态相似 25000与模型对照组状态相似 50000与模型对照组状态相似 1 00000与模型对照组状态相似 2 00000与模型对照组状态相似 山牡荆根和心材12500与模型对照组状态相似 25000与模型对照组状态相似 50000与模型对照组状态相似 1 00000与模型对照组状态相似 2 00000与模型对照组状态相似

3.1.2 抗炎功效评价

在本次实验条件下，模型对照组斑马鱼较正常对照组炎症部位中性粒细胞数量显著增加，具有统计学差异（＜0.001），阳性对照组（乙酸地塞米松）较模型对照组炎症部位中性粒细胞数量减少，且具有统计学差异（＜0.001），山牡荆枝叶1 000和2 000 µg/mL浓度组均较模型对照组炎症部位中性粒细胞数量减少，具有统计学差异（＜0.05，＜0.001），山牡荆果实1 000 µg/mL组可以显著减少炎症部位中性粒细胞数量，具有统计学差异（＜0.05），山牡荆根和心材500、1 000、2 000 µg/mL组可以显著减少炎症部位中性粒细胞数量，具有统计学差异（均＜0.001）。详见表2。

表2 样品抗炎功效评价实验结果（n=10）

组别浓度/μg·mL-1炎症部位中性粒细胞数量（个，mean ± SE）正常对照组—9.00 ± 0.856模型对照组—140 ± 9.26###乙酸地塞米松32.664.0 ± 2.44***山牡荆枝叶500118 ± 6.031 00099.0 ± 5.22*2 00076.6 ± 5.14***山牡荆果实500112 ± 5.941 000104 ± 4.65*2 000128 ± 11.0山牡荆根和心材50081.6 ± 7.34***1 00093.3 ± 6.25***2 00072.1 ± 4.77***

注：与正常对照组比较，###＜0.001；与模型对照组比较，*＜0.05，***＜0.001。

3.2 肾保护功效评价

3.2.1 MTC测定

在本实验条件下，山牡荆枝叶、山牡荆果实、山牡荆根和心材对模型斑马鱼的MTC均为2 000 μg/mL。详见表3。

表3 样品肾保护功效浓度摸索实验结果（n=30）

组别浓度/μg·mL-1死亡数/尾死亡率/%表型 正常对照组—00未见明显异常 模型对照组—0030尾肾性水肿 山牡荆枝叶12500与模型对照组状态相似 25000与模型对照组状态相似 50000较模型对照组状态佳 1 00000较模型对照组状态佳 2 00000较模型对照组状态佳 山牡荆果实12500与模型对照组状态相似 25000与模型对照组状态相似 50000较模型对照组状态佳 1 00000较模型对照组状态佳 2 00000较模型对照组状态佳 山牡荆根和心材12500与模型对照组状态相似 25000与模型对照组状态相似 50000与模型对照组状态相似 1 00000与模型对照组状态相似 2 00000较模型对照组状态佳

3.2.2 肾保护功效评价（表型观察）

在本实验条件下，与正常对照组比较，模型对照组肾性水肿数量显著增加，具有统计学差异（＜0.001），肾性水肿发生率100%，与模型对照组比较，阳性药地塞米松组肾性水肿数量显著减少，具有统计学差异（＜0.001），肾性水肿发生率10%，山牡荆枝叶组和山牡荆果实组500、1 000、2 000 μg/mL肾性水肿数量显著减少，具有统计学差异（均＜0.001），肾性水肿发生率≤10%，山牡荆根和心材组500、1 000、2 000 μg/mL肾性水肿数量显著减少，具有统计学差异（＜0.05，＜0.001，＜0.001），肾性水肿发生率分别为80%、43%和17%。详见表4和图1。

表4 样品肾保护功效评价（表型观察）实验结果（n=30）

组别浓度/μg·mL-1肾性水肿数量/尾肾性水肿发生率/% 正常对照组—00 模型对照组—30###100 地塞米松9.813***10 山牡荆枝叶5003***10 1 0002***7 2 0000***0 山牡荆果实5003***10 1 0000***0 2 0000***0 山牡荆根和 心材50024*80 1 00013***43 2 0005***17

注：与正常对照组比较，###＜0.001；与模型对照组比较，*＜0.05，***＜0.001。

图1 样品处理后斑马鱼肾性水肿典型图

注：箭头所指为肾性水肿。

3.2.3 肾小球滤过功效评价

在本实验条件下，模型对照组较正常对照组全身荧光强度显著增加，具有统计学差异（＜0.001），与模型对照组相比，阳性对照药地塞米松可以显著减少全身荧光强度，具有统计学差异（＜0.001），山牡荆枝叶500、1 000、2 000 µg/mL组全身荧光强度显著减少，具有统计学差异（＜0.001，＜0.001，＜0.01），山牡荆果实500、1 000、2 000 µg/mL组全身荧光强度显著减少，具有统计学差异（＜0.001，＜0.001，＜0.01），山牡荆根和心材500、1 000、2 000 µg/mL组全身荧光强度显著减少，具有统计学差异（＜0.05，＜0.01，＜0.001）。详见表5。

表5 样品肾小球滤过功效评价实验结果（=10）

组别浓度/μg·mL-1全身荧光强度（像素，mean ± SE）正常对照组—446 089 ± 22 667模型对照组—778 694 ± 69 281###地塞米松9.81312 847 ± 12 543***山牡荆枝叶500352 187 ± 12 625***1 000348 159 ± 17 366***2 000371 151 ± 21 534**山牡荆果实500298 047 ± 10 073***1 000338 076 ± 14 659***2 000364 084 ± 19 045**山牡荆根和心材500375 680 ± 21 647*1 000354 541 ± 17 771**2 000274 747 ± 8 252***

注：与正常对照组比较，###＜0.001；与模型对照组比较，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

4 结论

LPS是一种内毒素，是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，当其作用于人类、大小鼠、斑马鱼或其他生物细胞时均会诱导炎症介质的产生[3]。中性粒细胞作为免疫应答的第一道屏障，具有活跃的变形运动能力，将LPS注射到斑马鱼上后，中性粒细胞可迅速穿出血管聚集到炎症部位进行吞噬免疫[4]。荧光显微镜下，可直接观察到中性粒细胞，通过中性粒细胞数量判断样品有无抗炎功效。

马兜铃酸副作用之一是具有强肾毒性，损伤肾小管上皮细胞，导致肾间质纤维化及肾萎缩，并出现低分子蛋白尿、严重贫血症状。在人体和斑马鱼上，马兜铃酸均可诱发肾脏功能异常和肾性水肿，引起不可逆性地肾损伤甚至死亡[5,6]。因斑马鱼幼鱼通体透明的特性，马兜铃酸处理后，肉眼或在显微镜下，可直接观察到肾性水肿的特征表型；肾小球滤过功能障碍导致斑马鱼不能将外源注射红色的荧光物质排出体外，因此可观察斑马鱼全身红色荧光强度分析肾小球滤过功能[7]。

通过建立斑马鱼细菌性炎症模型，研究发现山牡荆枝叶、山牡荆果实和山牡荆根和心材均具有抗细菌性炎症功效。其中山牡荆根和心材抗细菌性炎症功效最好，其次是山牡荆枝叶。

通过建立斑马鱼肾损伤模型，研究发现山牡荆枝叶、山牡荆果实、山牡荆根和心材均具有肾保护功效，具体表现为减少肾性水肿发生率和促进肾小球滤过功能。其中山牡荆枝叶和山牡荆果实的肾保护功效最好，其次是山牡荆根和心材。

本文通过建立斑马鱼细菌性炎症模型和肾损伤模型，发现山牡荆有抗细菌性炎症和肾保护功效，为进一步开发山牡荆中药材的药用用途提供了依据。

[1]广西壮族自治区食品药品监督管理局. 广西壮族自治区瑶药材质量标准(第一卷)[M]. 南宁: 广西科学技术出版社，2014.

[2]王飞娟，景鹏，王燕，等. 山牡荆提取物对大鼠慢性肾炎模型的药效学实验研究[J]. 中医药导报，2017，23(8): 28-30.

[3]周俊怡，周严严，边宝林，等. LPS诱导斑马鱼炎症实热模型构建及脂质生物标志物筛选研究[J]. 浙江中医药大学学报，2018，42(10): 782-789.

[4]KO E Y, HEO S J, CHO S H, et al. 3-Bromo-5-(ethoxymethyl)-1, 2-benzenediol inhibits LPS-induced pro-inflammatory responses by preventing ROS production and downregulating NF-κB in vitro and in a zebrafish model[J]. International Immunopharmacology, 2019, 67: 98-105.

[5]王雪，刘可春，王希敏，等. 大黄酸对马兜铃A引起的斑马鱼肾脏损伤的保护作用[J]. 中国药理学通报，2016，32(3): 361-365.

[6]WANG X, GIUSTI A, NY A, et al. Nephrotoxic effects in zebrafish after prolonged exposure to aristolochic acid[J]. Toxins, 2020, 12(4): 217.

[7]DING Y J, CHEN Y H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2012, 261(1): 59-65.

Study on Pharmacodynamic Evaluation of Extracts from Different Parts of(Lour.) Will

Objective: To evaluate the anti-bacterial inflammatory and renal protective effects of extracts from different parts of(Lour.) Will. Methods: Using zebrafish from 3 days after fertilization to determine the maximum detection concentration of anti-bacterial inflammation efficacy in(Lour.) Will samples and evaluate its efficacy; the maximum concentration of renal protection was measured in zebrafish 2 days after fertilization and its efficacy was evaluated. Results: The MTC of branches and leaves, fruits, roots and heartwood of(Lour.) Will to model zebrafish were 2000 μg/mL. Compared with the model control group, the number of neutrophils in the inflammatory sites of(Lour.) Will was reduced in 1000 and 2000 µg/mL concentration groups in the branches and leaves of(Lour.) Will, 1000 µg/mL concentration groups in the fruits of(Lour.) Will, 500, 1000 and 2000 µg/mL concentration groups in the roots and heartwood of(Lour.) Will, with statistical difference. The number of renal edema in the 500, 1000, 2000 μg/mL concentration groups of branches and leaves, fruits, roots and heartwood of(Lour.) Will was significantly decreased compared with the model control group, with statistical difference. Conclusion: The branches and leaves, fruits, roots and heartwood of(Lour.) Will have the effects of anti-bacterial inflammation and renal protection.

Vitex quinata (Lour.) Will ; extract; zebrafish; bacterial inflammation; renal protection

R284

A

1008-1151(2023)07-0056-04

2023-01-09

吕林艳（1981－），女，广西梧州制药（集团）股份有限公司高级工程师，从事药理研究和临床研究工作。

麦志雄（1977－），男，广西梧州制药（集团）股份有限公司高级工程师，从事中药、民族药药效学研究及安全性评价工作。