黄连解毒汤通过促进自噬减轻脓毒症大鼠心肌损伤

江桂通 王 腊 田维毅*

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550000；2.贵州省岑巩县人民医院，贵州 岑巩 556000

迄今为止，脓毒症仍是一个世界公共卫生问题，其发病率及病死率双高仍困扰着全球的医务工作者[1]。脓毒症病理过程异常复杂，目前仍尚未完全阐明，涉及炎症的失控、机体免疫系统抑制及凝血功能障碍等多个方面[2]。脓毒症诱导宿主多器官功能障碍综合征与其高死亡率息息相关，其中心脏功能障碍是关键[3]。脓毒症诱导的心肌病其特征包括心肌细胞死亡以及过度炎症反应等。自噬(Autophagy)作为细胞的一种自我保护机制[4]，在应激条件下，Beclin-1复合物与唯一具有跨膜结构的自噬核心调控蛋白(ATG9)调控自噬泡的形成与自噬膜延伸的过程[5-6]，将受损的蛋白质转运至溶酶体，底物蛋白P62也随之降解，以维持细胞内环境的稳定，促使细胞存活。自噬泡的形成到自噬体与溶酶体相结合，涉及到LC3-I/LC3-II的比率及P62蛋白的表达水平，这是评估自噬活化程度的主要方式[7]。目前公认自噬作为细胞适应机制能减轻细胞损伤和凋亡，脓毒症中自噬的维持可能有助于减轻脓毒症引起的器官损伤[8]。因此，探索自噬现象对炎症性疾病的治疗具有重大的意义[9]。

脓毒症在中医学古籍中虽没有具体的病名记载，但根据其发病的主症，归纳其病因、病机，可归属于“热毒”“温毒”一类[10]。热毒贯穿于脓毒症发病之始终为基础，清热解毒是脓毒症治疗的核心环节，并在疾病的发生发展中起着决定作用[10-12]。黄连解毒汤始载于唐代王焘《外台秘要》一书中，由黄连、栀子、黄芩及黄柏组成，具有泻火解毒之功效，为清热解毒的代表方之一。课题组前期研究[13]发现，黄连解毒汤含药血清能显著降低脂多糖(LPS)诱导的脓毒症细胞模型炎症因子(TNF-α、IL-6)表达水平，诱导RAW264.7巨噬细胞自噬相关基因Beclin-1的表达[14]，为本研究提供了前期实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器 35只SPF级SD雄性大鼠，体重在150～180 g之间，购买于湖北省预防医学科学院，许可证号SYXK(黔)2018-0001。实验前适应性饲养1周，分笼饲养于贵州中医药大学东垣楼。本实验由贵州中医药大学伦理委员会批准，实验操作及过程严格执行伦理委员会的相关规定。Affinity抗体江苏常州艾菲尔生物科技(LC3、Beclin-1、P62)，兔源，货号分别为[AF5402，AF5128，AF5384]。3-18K型低温离心机(德国Sigma公司)；Bio-Rad蛋白凝胶电泳仪、Bio-Rad凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 药材与制备水煎剂 按王焘《外台秘要》黄连解毒汤原方比例配伍(黄连9 g、黄芩6 g、黄柏6 g、栀子9 g)，购自北京同仁堂贵阳店。按课题组常规方法制备水煎剂，加热浓缩至含生药浓度为1 g/mL存放4 ℃保存备用[15]。

1.3 实验分组 35只SPF级SD雄性大鼠随机分组。①Sham组(n=7)；②CLP组(n=7)；③HLJDD+CLP(HLJDD)组(n=7)；④HLJDD+Rap+CLP(H+RAP)组(n=7)；⑤HLJDD+3-MA+CLP(H+3MA)组(n=7)。在CLP手术前1周，给予HLJDD：灌胃给药3.5g·kg-1·d-1药液灌胃，1 mL/100 g体重，每天1次，持续7d[15]。Sham组及CLP组给予同等体积的生理盐水灌胃。雷帕霉素、3-甲基腺苷溶于二甲亚砜，在CLP手术后1 h内腹腔注射。在Sham、CLP和HLJDD组腹腔注射相同体积的生理盐水。雷帕霉素(RAP，3 mg/kg，MedChemExpress，新泽西，美国)、3-甲基腺嘌呤(3-MA，30 mg/kg，MedChemExpress，新泽西，美国)、二甲亚砜(DMSO，Sigma-Aldrich，美国)。

1.4 建立脓毒症大鼠模型 盲肠结扎穿孔术[16](CLP)建立脓毒症动物模型。大致步骤如下：腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠后固定，腹中线1.5 cm切口暴露盲肠，丝线结扎于回盲瓣的四分之一处，用20号针头进行两次盲肠穿刺挤出粪便后擦拭，将暴露的盲肠放回腹腔，用无菌的6.0手术缝线将腹壁分层缝合。术后，用3 mL预热的无菌盐水皮下注射进行液体复苏，自由饮食、活动。对Sham组大鼠进行同样的操作但盲肠无结节及穿孔。

1.5 大鼠模型血常规检测 术后3 d仍存活的大鼠，麻醉后采血经兽用全自动血液细胞分析仪检测，选取指标有白细胞(WBC)计数；中性粒细胞数目(Gran)；中性粒细胞百分比(Gran%)。

1.6 HE染色观察心脏组织病理变化 将心脏组织用甲醛固定，石蜡包埋，切成5 μm厚片。切片在二甲苯中孵育5 min。然后，将样品依次在100%，95%，80%，75%乙醇梯度孵育；蒸馏水冲洗2 min，切片用苏木精染色5 min，再漂洗，在伊红溶液中孵育2 min。最后，切片脱水，密封，并在显微镜下检查。

1.7 蛋白印迹法检测心脏组织中自噬蛋白LC3、Beclin-1、P62表达水平 提取大鼠心脏组织总蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白质经凝胶电泳后转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h。用兔来源的单克隆抗体(LC3 1∶1000、Beclin-1 1∶1 000、P62 1∶1000)在4 ℃孵育过夜。摇床TBST洗膜15 min/次，共3次，然后将PVDF膜与鼠源抗兔二级单克隆抗体(1∶2000)在37 ℃孵育1h。同样方法洗涤后，配置ECL显影液显影，曝光采集条带图象保存，以GAPDH为内参，Image Lab软件分析各目的蛋白条带的灰度值。

1.8 检测大鼠心脏组织中ATG9 mRNA的表达水平 采用Q-PCR法检测大鼠心脏组织中ATG9 m RNA的表达差异。称取各组大鼠心脏组织研磨，Trizol法提取总RNA，逆转录成cDNA，进行实时荧光定量PCR。按照试剂盒说明进行操，引物由上海生工公司设计合成，以GAPDH为内参(F5’ACAGCAACAGGGTGGTGGAC3’;R5’TTTGAGGGTGCAGCGAACTT3’)检测各组大鼠心脏中ATG9 mRNA(F5’TTACTGTGGAGGTCGTCGGTGTGGG3’;R5’ GGATGTGAAAAGGGCATTCTCTGGG3’)。以2-ΔΔCt计算目的m RNA的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 观察黄连解毒汤对脓毒症大鼠心脏病理情况 HE染色结果显示：Sham组大鼠心肌细胞结构清晰完整，排列整齐，染色均匀。CLP组大鼠心肌细胞排列紊乱可见炎性细胞浸润，染色加深，部分心肌细胞肿胀明显并有坏死。HLJDD组与CLP组相比较，心肌肌纤维排列相对规则，心肌间间隙变小，炎症细胞浸润减弱。H+RAP组心肌细胞形态结构边界较HLJDD组明显改善，而H+3MA组则心肌细胞排列紊乱、坏死程度增加。如图1所示。

图1 各组大鼠心脏组织病理图(HE染色，×200)

2.2 黄连解毒汤对脓毒症大鼠血常规的影响 与Sham组相比，CLP组大鼠全血中(WBC、Gran#、Gran%)均明显上调(P<0.05)。与CLP组相比，HLJDD组大鼠的(WBC、Gran#、Gran%)均明显下调，H+RAP组指标进一步下降，而H+3MA组则呈现相反的趋势(P<0.05)。见表1。

表1 黄连解毒汤对脓毒大鼠血常规的影响

2.3 黄连解毒汤对自噬相关蛋白(LC-3、Beclin-1、P62)的影响 与Sham组比较，CLP组大鼠心脏组织中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达显著降低，P62蛋白表达显著升高(P<0.05)。与CLP组比较，HLJDD组大鼠心脏组织中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达明显上调，P62蛋白表达明显降低，H+RAP组的LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达则显著上调，P62蛋白表达显著降低。而H+3MA组则呈现相反的趋势，LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达则显著降低，P62蛋白表达显著增加(P<0.05)。见表2和如图2所示。

表2 黄连解毒汤对脓毒症大鼠自噬相关蛋白的影响

图2 各组大鼠心脏组织自噬相关蛋白电泳图

2.4 黄连解毒汤对脓毒症大鼠自噬基因ATG9 m RNA的影响 与Sham组比较，CLP组大鼠心脏组织中自噬基因ATG9 m RNA表达显著降低(P<0.05)。与CLP组比较，HLJDD组大鼠的表达明显上调，H+RAP组的进一步上调。而H+3MA组则呈现相反的趋势，ATG9 m RNA表达显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 脓毒症大鼠心肌组织自噬基因ATG9 m RNA的表达

3 讨论

脓毒症是一种由感染引起的全身性炎症反应综合征，其中诱发的心肌病治疗耗资颇大且疗效欠佳，目前其病死率仍居高不下[17]。临床研究[18]发现，罹患脓毒症患者的死亡超过70%是由器官衰竭引起的，其中超过50%表现出心肌功能障碍。脓毒症期间不受控制的炎症因子直接抑制心脏，是诱发心肌病的主要机制，伴随着严重的心脏功能障碍对患者造成致命打击[19]。巨噬细胞作为人体中最主要的免疫细胞，在脓毒症期间被过度激活并释放出大量炎性因子 (IL-1、IL-6、TNF-α)。在团队前期研究[13]发现，黄连解毒汤能显著地提高CLP诱导的脓毒症动物模型生存率、降低炎症因子(TNF-α、IL-6)，表现出明显的抗炎作用。这些研究结果与黄鑫等[20]和李翀等[21]的研究结果相符。白细胞、中性粒细胞是机体抵御微生物侵袭的第一道防线，是免疫防御以及解决过度炎症所必需的，可以评估脓毒症病程严重状态的指标[22-23]。此次实验笔者采用血常规检测大鼠全血中感染指标，证实了黄连解毒汤减轻脓毒症大鼠的感染的显著作用(表1)。在细胞和分子水平上，炎症和细胞的凋亡被认为是脓毒症心功能障碍的关键病理生理学现象[24]。笔者在光镜下观察脓毒症大鼠心脏HE病理切片。结果显示：黄连解毒汤能减轻脓毒症大鼠心脏组织局部炎症，减轻心肌细胞的损伤情况。细胞自噬可以降解受损蛋白质以维持正常功能的途径[25]。但在心血管疾病中，特别是脓毒症诱导的急性心肌损伤中，自噬的作用机制尚不明确。有研究[26]发现，小干扰RNA(siRNA)沉默自噬基因ATG5和3-甲基腺嘌呤抑制自噬，增加了心肌细胞凋亡的发生。然而，纠正自噬受损，改善舒张期充盈增加心脏收缩力，减少心肌细胞凋亡[27-28]。本研究发现黄连解毒汤促进了脓毒症大鼠心脏自噬通量的增加，从血常规结果及观察心脏病理切片，自噬的增加进一步减轻了脓毒症大鼠的心肌损伤程度，而自噬受阻则加重其损伤程度(图2、表2、表3)，这些结果与WU等[29]的研究相符。

脓毒症临床证候复杂多变，主次真伪变化多端。治病必求本，辨证必求因。《素问·至真要大论》指出“必伏其所主，而先其所因”。热毒贯穿于脓毒症之始终，并在疾病的发生发展起主导作用。清·汪讱庵曰：“毒者，即火邪之盛也。”黄连解毒汤是清热解毒治法代表方剂之一，方中黄连为君清中焦之火；黄芩为臣辅以清上焦之火；黄柏佐助清下焦；栀子通泻三焦，引热下行，从小肠膀胱而出；四药合力，三焦兼顾。

综述所述，本研究发现，黄连解毒汤有减轻脓毒症大鼠炎症水平及心脏组织的损伤作用，可能是通过增加自噬的途径。然而，黄连解毒汤对于自噬具体的调控机制尚且不清楚，有待于后续的研究。