嵌合抗原受体T 细胞治疗恶性肿瘤的研究进展

杨 翀，张 毅

（天津市环湖医院，天津 300350）

嵌合抗原受体（CAR）是源自编码单链可变片段（scFv）转基因的嵌合免疫球蛋白T 细胞受体（TCR）分子，能够识别并结合肿瘤相关抗原（TAA），通过结构域和共刺激域的激活信号激活嵌合抗原受体T 细胞（CAR T），诱导细胞因子释放和转录因子表达，促进T细胞的活化和功能，最终产生针对肿瘤细胞的细胞毒活性［1］。临床上，CAR T 治疗首先需要收集患者的外周血和T 细胞，T 细胞在体外进行刺激扩增并通过病毒载体转入特定的CAR 基因，称为CAR T，随后将CAR T 回输给患者，在患者体内行使设定的肿瘤杀伤作用［2］。相较于化疗，放疗及手术治疗，这种治疗方式缓解率更高，副作用更少，患者预后生活质量更高。

目前，CAR T 过继转移在治疗白血病和淋巴瘤等多项临床试验研究中取得了惊人的结果，但对实体瘤的作用有限，其原因包括免疫逃逸、CAR T 细胞迁移、免疫抑制性肿瘤微环境和抗原表达异质性等。此外，CAR T 是活性药物，虽具有显著的抗肿瘤活性，但也可诱发严重的毒性反应。因此，CAR T 对实体瘤方面研究的新方法应专注于增强效力而非增加毒性。本综述概述了CAR T 的发展现状，并对其在血液系统恶性肿瘤和实体瘤研究应用中遇到的诸多挑战及应对方法进行总结。

1 CAR 的结构与演变

CAR 的结构主要由细胞外域和细胞内域组成。细胞外域包括靶向域和铰链区；细胞内域包括跨膜域（TM）、共刺激域（通常为CD3ζ）和激活域［3］。CAR 的靶向域通常来源于单克隆抗体（mAb）的单链可变片段（scFv），负责识别并结合在肿瘤细胞表面表达的TAA［4］。铰链区主要用于连接靶向域和TM 域，主要来源于CD8、CD28、IgG1 和IgG4。细胞内域在T 细胞活化、增殖、持久性和细胞毒性中起关键作用［5］。CAR 的TM 结构域源自CD3ζ、CD8α、CD4、CD28 和诱导型T细胞共刺激物（ICOS）等分子。此外，共刺激域是CAR的重要组成部分，因其可以促进CAR T 细胞的不同特性。迄今为止，CD28、CD137（4-1BB）、CD134（OX40）、ICOS、CD27、MYD88-CD40 和KIR2DS2 已被用作各种试验研究中的共刺激域［6］。CAR 结构中使用的激活域在遇到靶抗原时对T 细胞激活具有关键作用，其主要来源于TCR-CD3 复合物的CD3ζ 部分。目前，已使用的其他激活域包括FcεRIγ、TCR 相关蛋白激酶70 kDa（ZAP70）的ζ 链和DAP12［6］。

第一代CAR 发现于20 世纪80 年代后期，仅包括scFv 和CD3ζ，在响应抗原时表现出有限的扩增和相对较短的持久性，并在临床研究中尚未显示出抗肿瘤功效［7］。第二代CAR 的临床活性可通过CD3ζ 结构域插入诱导，即共刺激域CD28 或CD137/4-1BB 被添加到CAR T 细胞的CD3ζ 内域，促进更强大和持久的T 细胞反应［8］。此外，靶向CD19 抗原（CD19 特异性scFv）的第二代CAR 对B 细胞恶性肿瘤具有高度活性，并具有良好的临床益处［8］。为了克服每个单独共刺激域的局限性，第三代CARs 同时结合两种共刺激信号（CD28 和4-1BB），与第二代相比，其具有更好的扩展性和更长的持久性［6］。近年来，由于在实体瘤患者中缺乏临床上成功的CAR T 疗法，CAR 结构的进一步改进已被用于提高CAR T 的功效。第四代CAR 构建体通过诱导促炎细胞因子的分泌，增强工程细胞的迁移和功效，提高抗肿瘤活性［9］。相比之下，第五代CAR 采用了完全不同的方法，旨在激活Janus激酶信号转导和转录激活因子（JAK-STAT）信号通路以促进T 细胞增殖。与第二代和第三代相比，第五代CAR T 细胞被证明具有更好的抗肿瘤作用和持久性。

2 血液系统恶性肿瘤中的CAR T

自2010 年以来，大量临床试验证明了针对CD19的CAR T 能够有效缓解急性淋巴细胞白血病（ALL）、弥漫性大B 细胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性淋巴细胞白血病的临床反应［10］。具有4-1BB/CD3ζ 共刺激结构域的Tisagenlecleucel（KYMRIAH，Novartis）于2018 年被欧洲药品管理局（EMA）批准用于B 细胞ALL（B-ALL），具有CD28/CD3ζ 共刺激域的Axicabtagene ciloleucel（YESCARTA，Kite Pharmaceuticals）于2017 年被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于大B 细胞淋巴瘤（BCL）［11-12］。Tisagenlecleucel 是一种自体T 细胞，带有编码CD19 特异性CAR 的慢病毒载体，在日本复发/难治性（r/r）B-ALL 患者亚组中表现出显著的疗效和可控的安全性，使其成为B-ALL 患者的有效治疗方法［12］。Axicabtagene ciloleucel 是一种CD19 特异性CAR T，主要用于治疗接受两种或多种全身治疗后复发或难治性大BCL 的成年患者［11］。以2×106CD19-CAR-T/kg 的剂量向111 例DLBCL 患者输注Axicabtagene ciloleucel，完全缓解率为54%，疗效显著［13］。第三代基于CD3ζ/CD28 的CD19 特异性的CAR T 产品Brexucabtagene Autoleucel（TECARTUS）于2020 年被FDA 和EMA 批准用于治疗套细胞淋巴瘤（MCL）［14］。然而，最新的长期随访研究显示，高达41%的ALL 患者会出现疾病复发，相比之下，DLBCL 的反应率似乎更持久，大多数患者在12 个月的随访期间没有复发［10］。总之，CAR T 疗法已成为治疗血液系统恶性肿瘤的重要选择。

3 CAR T 治疗血液系统恶性肿瘤存在的问题

3.1 CAR T 持久性和增殖不足 CAR T 足够的持久性和增殖率被证明与缓解率相关［15］。CAR T 的持久性和增殖率取决于共刺激域。CAR 中含有CD28 结构域的T 细胞获得了具有快速增殖和葡萄糖代谢的效应记忆表型，这导致了更快的肿瘤细胞清除速率。相比之下，基于4-1BB 的CAR T 表现出较慢的抗肿瘤活性，T 细胞主要分化为具有增强耐力、氧化代谢和增加线粒体生物发生的中央记忆细胞。淋巴细胞不同亚群的持久性和活性似乎依赖于不同的共激活域。细胞毒性（CD8+）CAR T 的持久性被证明取决于4-1BB 信号传导，而辅助（CD4+）CAR T 需要ICOS 信号传导。使用针对亚群调整的CAR 分子重新定向T 细胞导致CAR T 在小鼠模型中的持久性和抗癌功效增强［16］。此外，CAR T 的亚群组成是影响治疗结果的一种方式。首个具有明确CD4/CD8 比率的CAR T 疗法似乎甚至适用于患有严重白细胞减少症的患者，目前正在接受FDA 的批准程序［17］。

然而，如果没有具有高增殖潜力的强效T 细胞，即使是完美的嵌合抗原受体也会表现不佳。目前，临床前试验通常是基于健康供体的T 细胞，不考虑肿瘤发生过程中发生的计数变化。研究表明，在肿瘤发生过程中，T 细胞获得耗竭表型，增殖能力降低，而这种变化在癌症晚期似乎是不可逆转的［18］。与健康细胞相比，耗尽的中枢记忆T 细胞具有不同的转录状态［19］。

3.2 抗原阴性疾病复发 CD19 抗原丢失是B-ALL患者在CD19 CAR T 治疗后复发的主要原因。CD19抗原丢失也显示在非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者中［20］。最近描述了导致抗原丢失的两种主要机制：抗原逃逸和谱系转换。

缺乏同源表位的表型相同疾病的复发是抗原逃逸的特征。B-ALL 中描述了CD19 的几种剪接变体。一些变体在抗原的细胞外部分缺乏CAR T 识别的表位，而其他变体缺乏跨膜区，导致CD19 表面表达的丧失［21］。在CAR T 输注之前，已经可以在患者中检测到肿瘤细胞中的CD19 剪接变体［22］。CAR T 只是刺激对治疗耐药的恶性细胞变体的选择。然而，也报道了抗原逃逸的其他机制。Friederike Braig 等［23］已经表明CD81（一种调节CD19 成熟和运输的蛋白质）的转录后改变导致CD19 表达的丧失和疾病的复发。另一方面，谱系转换机制取决于癌细胞对治疗的反应从淋巴样到髓样表型的变化［24］。克服这些障碍的主要方法如上所述，依赖于同时靶向多个表位。

4 实体瘤中的CAR T

随着CAR T 疗法在血液系统恶性肿瘤的临床成功，在实体瘤中的试验也紧随其后。迄今为止，已经启动了100 多项CAR T 在实体瘤中的临床试验，其中大部分使用的是第二代或第三代CAR，并且有至少20 项已发表研究结果。虽然在实体瘤中，CAR T 细胞疗法迄今未能表现出与血液系统恶性肿瘤相似的缓解率，但在各种实体瘤临床试验中仍有部分患者获得部分或完全缓解，说明CAR T 疗法对实体瘤是有效的。在一项靶向神经母细胞瘤的双唾液酸神经节苷脂2（GD2）特异性CAR T 治疗的Ⅰ期临床试验中，入组时患有活动性疾病的11 例患者中有3 例实现了完全缓解［25］。靶向肉瘤的人表皮生长因子受体2（HER2）特异性CAR 的Ⅰ/Ⅱ期临床研究也报道了令人鼓舞的结果，在17 例可评估的患者中，3 例病情稳定，能够接受手术切除残留肿瘤，无需进一步治疗即可完全缓解［26］。在Brown CE 等［27］的一项研究中，使用IL13Rα2特异性CAR T 进行区域多剂量治疗后，1 例播散性胶质母细胞瘤患者完全缓解。总之，CAR T 疗法在实体瘤试验中的临床缓解率不如血液系统恶性肿瘤显著，但迄今为止观察到的临床表现也证实了其在实体瘤中的治疗活性。

5 CAR T 治疗实体瘤的障碍

5.1 肿瘤抗原异质性和肿瘤抗原逃逸 实体瘤由分子异质亚群组成，不同肿瘤的抗原表达不同。异源靶抗原的表达限制了CAR T 治疗的结果，并与抗原逃逸，肿瘤耐药和去除大多数免疫原性表位后的复发有关［20］。在接受表皮生长因子受体（EGFR）靶向CAR T 治疗的复发性胶质母细胞瘤患者中，已经显示出由肿瘤抗原丢失引起的肿瘤耐药性［28］。因此，解决肿瘤异质性和克服肿瘤逃逸是实现长期缓解的必要条件。

研究人员一直致力于构建多靶CAR T，旨在通过识别多种抗原来抑制肿瘤逃逸。串联CAR T 具有两个scFV，可识别CAR 构建体的不同抗原。一项研究在胶质母细胞瘤小鼠模型中比较了共表达HER2 和IL13Rα 的串联CAR T 与单特异性CAR T 的效果，发现前者抗原逃逸减少，并提高了肿瘤清除率［29］。目前已经开发了同时表达多种CAR 构建体的CAR T。一项研究发现，在自体小鼠模型中，针对3 种不同胶质母细胞瘤靶标的三价CAR T 在不同小鼠之间出现抗原异质性，并促进了肿瘤清除［30］。在肿瘤环境中靶向突变抗原或非肿瘤细胞抗原，例如成纤维细胞或肿瘤脉管系统，也可以克服抗原逃逸［31］。如一项研究所示，识别EGFRvⅢ的EGFRvⅢCAR T 抑制了胶质母细胞瘤模型中的肿瘤生长［32］。

其他克服抗原逃逸的尝试还包括使用表达双特异性T 细胞接合物（BiTE）的修饰T 细胞和能够诱导内源性免疫反应以协同消除肿瘤的免疫调节剂。BiTEs 的主要机制是利用两个靶向CD3 和肿瘤抗原的scFv 将T 细胞与肿瘤细胞连接起来，从而招募和激活内源性T 细胞杀死肿瘤细胞。一项研究发现，表达EGFR 靶向BiTE 的CAR T 能够在胶质母细胞瘤模型中招募内源性T 细胞，有效减弱抗原表达异质性，并抑制抗原逃逸［33］。此外，表达CD40 配体（CD40L）的CAR T 也已被证明可提供CD40 激活信号并激活内源性抗原呈递细胞（APC）以分泌刺激性细胞因子，从而增强抗肿瘤功效并克服抗原逃逸［34］。

5.2 有限的CAR T 运送 从血液到肿瘤部位的成功转运是CAR T 攻击肿瘤细胞的先决条件。与容易进入血液恶性肿瘤不同，实体瘤常会因各种原因导致T细胞归巢效率低下和肿瘤部位浸润受限。肿瘤组织表达的趋化因子失配，与CAR T 上的趋化因子受体（CCR）不兼容导致T 细胞归巢效率低下［35］。由致密细胞外基质（ECM）构成的物理屏障以及实体瘤中异常的肿瘤血管则进一步抑制了浸润。局部输注将CAR T递送至肿瘤部位或颅腔可以有效避免全身性注射的毒性和脱靶效应，是一种潜在的手段。临床前模型显示，颅内注射靶向HER2 和IL13Ra2 的CAR T 治疗乳腺癌脑转移和胶质母细胞瘤的疗效显著［36］。局部注射虽然具有较好的疗效，但理论上这种方法仅限于单个肿瘤病变。

为了增强T 细胞浸润并实现细胞归巢，探索其他方法是有必要的。通过直接优化CAR T 表达的CCR，可以更好地与肿瘤细胞表达的趋化因子配体（CCL）相互作用。Moon 等［37］利用慢病毒载体获得表达CCR2b的抗间皮素CAR T，该细胞与癌细胞分泌的CCL2 相互作用，改善了T 细胞浸润，并提高了抗肿瘤活性。另一项研究发现，表达CXCR2 的CAR T 可以促进T 细胞归巢并增强抗肿瘤反应［38］。此外，CCR4 等其他CCR也已被证明在不同程度上是有效的。

为了增强T 细胞的迁移和浸润能力，另一种潜在的方法被提出，即通过改造CAR T 来识别基质细胞相关抗原或分泌基质降解酶来破坏实体瘤中的物理屏障。在许多实体瘤中的成纤维细胞上均有表达的蛋白酶成纤维细胞活化蛋白（FAP）使这种方法看到了希望。Wang 等［39］研究发现，靶向肿瘤基质中FAP 的CAR T 可以有效抑制肿瘤生长，增强宿主免疫力，而不会产生严重的毒性反应。肿瘤基质等物理障碍限制了T 细胞的浸润。由于硫酸肝素蛋白聚糖（HSPG）是CAR T 进入肿瘤细胞必须降解的主要成分，因此表达乙酰肝素酶（降解HSPG 的酶）的CAR T 可能改善T细胞浸润能力。一项旨在补充基质中乙酰肝素酶不足的研究发现，表达乙酰肝素酶的CAR T 可以增强T细胞浸润并提高抗肿瘤活性［40］。

5.3 微环境免疫抑制 即使成功将CAR T 运送到肿瘤部位，高度免疫抑制的TME 也可以限制其发挥作用。实体瘤的抑制性TME 主要是由多种免疫抑制分子和抑制性免疫细胞组成的。抑制性免疫细胞（如调节性T 细胞）可以通过接触依赖性的方式，阻碍CAR T 增殖，降低细胞毒性。而一些抑制性因子［如转化生长因子-β（TGF-β）和IL-10］则可以促进T 细胞通过间接接触导致细胞无反应。近来已经发现，多种方式可以克服免疫抑制性TME，提高T 细胞的存活和增殖［41］。

一些研究致力于修饰CAR T 过表达的细胞因子促进炎症，如IL-12、IL-15 和IL-18。IL-12 是一种促炎细胞因子，因其具有增强CD8+细胞的细胞毒性能力，并可以通过巨噬细胞的募集和参与降低肿瘤逃逸而成为研究热点［42］。Yeku 等［43］研究发现分泌IL-12的工程改造的T 细胞可以显著延长生存时间，增加细胞毒性，抵抗细胞凋亡和PD-L1 诱导的功能抑制。在白血病模型中，还发现表达IL-15 的抗CD19 CAR T细胞实现持久性并诱导持续缓解，这可能与记忆细胞亚群的形成有关［44］。同样，在神经母细胞瘤转移模型中，用IL-15 优化GD2 CAR T 可提高抗肿瘤能力［45］。此外，有关分泌IL-18 的CAR T 的相关研究表明，这些细胞具有增强增殖和浸润能力，并且可以募集内源性免疫细胞来调节TME［46］。

阻断CAR T 和TME 中的免疫抑制信号可以使CAR T 免受免疫抑制分子的影响。TGF-β 信号传导是重要的免疫抑制途径，因此促进抗肿瘤反应的可行替代方法是阻断TGF-β 信号传导。一项研究发现，在临床前前列腺癌模型中，TGF-β 显性阴性受体（DNR）可以有效地保护CAR T 免受免疫抑制细胞因子的干扰，抑制信号转导［47］。同时，Sukumaran 等［48］用受体工程改造CAR T，将TGF-β 信号转化为4-1BB或IL-12 刺激信号，可以改善抗肿瘤作用，并对免疫抑制信号产生抗性。另一项研究还发现，阻断TGF-β信号的CAR T 不仅可以增强细胞毒性和提高抗肿瘤活性，而且还可以保护相邻的免疫细胞免受TGF-β介导的免疫抑制作用［49］。

同样，对胰腺癌模型的研究表明，表达反向细胞因子受体的CAR T 可以促进T 细胞存活。将IL-4 的细胞外片段和IL-7 受体的细胞内片段融合，可以使细胞因子的免疫抑制信号转化为激活信号［50］。此外，营养缺乏、低pH 值和低氧等代谢紊乱是TME 的另一个特征，而代谢竞争则进一步限制了CAR T 的活性［51］。改变CAR T 的代谢途径也可能是一种有效的手段。例如，在低氧条件下，可以稳定表达转录因子低氧诱导因子1-α（HIF-1α），通过修饰CAR T 表达HIF-1α，具有抗缺氧的能力，可以增加CAR 表达和提高溶瘤作用，改善抗肿瘤作用［52］。

6 CAR T 疗法的毒性

CAR T 疗法给肿瘤患者带来了希望，但难以预测的急性毒性阻碍了其广泛实施。细胞因子释放综合征和免疫效应细胞相关神经毒性综合征是发生最频繁、症状最突出的急性毒性反应，症状严重者可能会危及到生命。其他毒性还包括与CAR T 相关的脑病综合征、巨噬细胞活化综合征、吞噬性淋巴细胞组织细胞增生、移植物抗宿主病、靶向肿瘤外毒性、过敏反应和感染。

6.1 细胞因子释放综合征 细胞因子释放综合征（CRS）是CAR T 疗法最常见的不良反应。CAR T 识别同源抗原，激活T 细胞和旁观者免疫细胞，IL-1、IL-6、IL-15 和干扰素γ（IFN-γ）等促炎细胞因子的过度释放，引起全身免疫激活，临床表现为高热、低血压、缺氧甚至多器官功能障碍［53-54］。在活化的免疫细胞中，巨噬细胞在CRS 的病理生理学中发挥着至关重要的作用［55］。CRS 通常发生在CAR T 输注后的第一周，可以通过使用托珠单抗（抗IL-6R 抗体）进行控制［56］。对于托珠单抗无反应或重度CRS 患者，建议使用皮质类固醇，但可能会影响CAR T 的有效性［56-57］。在极少数情况下，CAR T 输注后也可能会出现全身性高炎症性疾病［57］。由于这种疾病的临床表现和实验室检查结果与CRS 相似，也可能出现具有较高死亡率的噬血细胞综合征，需额外使用依托泊苷或阿糖胞苷治疗［58］。

6.2 免疫效应细胞相关神经毒性综合征 免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）是CAR T 疗法第二个最常见的不良反应。在轻度病例中，患者通常会出现注意力下降、语言障碍和书写障碍。而在严重的情况下，患者通常会出现癫痫发作、运动无力、颅内压升高、视神经盘水肿和脑水肿。虽然在大多数情况下是可逆的，但ICANS 会延长住院时间，需要对部分患者进行重症监护，可能会造成延迟康复，护理成本增加［59］。目前，CRS 的病理生理学已被广泛研究，并且已经制定了抗IL-6 治疗的适当治疗方法，但ICANS 的病理生理学及其最佳治疗方法尚不清楚［56］。ICANS的发展有两个主要假设，即细胞因子扩散到大脑和T细胞进入中枢神经系统［60］。第一种假设认为，ICANS的发展与循环内和脑脊液中高水平的炎性细胞因子有关，单核细胞衍生的IL-1 最近被认为是神经毒性的关键驱动因素［60］。第二种假设认为，血脑屏障通透性增加可能会促进T 细胞进入中枢神经系统导致神经炎症［61］。与CRS 同时出现的神经毒性通常症状较轻且持续时间较短，而CRS 后出现的神经毒性通常更严重（≥3 级）且持续时间较长［56］。与CRS 类似，ICANS 管理取决于毒性等级，对CRS 并发ICANS 的患者推荐使用托珠单抗，ICANS 症状严重的患者皮质类固醇的作用更显著。

7 总结和展望

CAR T 疗法一直是免疫细胞治疗领域的焦点，极有希望彻底改变某些肿瘤（特别是血液肿瘤）的临床治疗现状。美国是全球最早开启CAR T 治疗临床试验的国家。2010 年以前，全球CAR T 治疗临床注册试验都集中在美国开展。我国从2012 年起开始了CAR T 治疗临床注册，每年新注册的CAR T 项目以数倍的速度爆发式增长，目前已成为全球CAR T 疗法临床试验注册数量最多的国家［62］。但是CAR T 疗法在技术上和临床应用上仍然存在着许多亟待解决的问题。

从短时间内的治疗效果看，CAR T 疗法对某些血液肿瘤的治疗效果十分显著，但若将观察期限进一步延长则会发现，许多患者在经过CAR T 治疗几个月甚至更长时间后，会出现肿瘤复发的现象，影响患者预后。因此，提高CAR T 激活程度，提高其增殖能力，并延长CAR T 在患者体内的存活时间是未来研究的重点方向之一。

目前，CAR T 疗法在血液系统恶性肿瘤中的治疗效果良好，而在实体瘤上的应用还是以尝试为主，虽然现在结果不明显，但无论是基础研究还是临床研究，都还没有证据表明这条路完全行不通，其在治疗实体瘤领域依然存在很大的发展空间。